弓形蟲P30-ROP2-HSP70復(fù)合基因疫苗的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由專性細(xì)胞內(nèi)寄生的弓形蟲病原體引起的一種人獸共患寄生蟲病，廣泛流行于世界各地。正常人感染弓形蟲后無(wú)明顯的臨床癥狀，但孕婦感染后可影響胎兒的發(fā)育，嚴(yán)重者導(dǎo)致畸胎、死胎，存活者也常有畸形和智力發(fā)育不全等后遺癥，并且近年來(lái)隨著人們生活水平的提高，食物來(lái)源的多樣化，飲食習(xí)慣的改變，飼養(yǎng)寵物人數(shù)的增多，弓形蟲感染呈明顯上升趨勢(shì)，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，但因其生活史復(fù)雜和致病機(jī)理尚不完全清楚，至今尚未找

2、到理想的治療藥物。近年來(lái)，隨著對(duì)弓形蟲抗原及其免疫保護(hù)性研究發(fā)現(xiàn)，研制疫苗可能是預(yù)防弓形蟲病的最佳策略。P30是國(guó)內(nèi)外研究最多的一種弓形蟲表膜蛋白，已被證明為重要的弓形蟲免疫保護(hù)性抗原；ROP2為弓形蟲棒狀體分泌的54kDa的蛋白，可以誘導(dǎo)對(duì)弓形蟲應(yīng)答的T細(xì)胞克隆(TCC)增生，刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及諸多細(xì)胞因子的產(chǎn)生，HSP70是高度保守的應(yīng)激蛋白，在免疫反應(yīng)中的主要作用是直接或間接加工遞呈抗原HSP70是一種非特異性的細(xì)胞保護(hù)蛋

3、白，是目前發(fā)現(xiàn)的主要分子伴侶蛋白之一[1]，并且有研究顯示，出于弓形蟲抗原成分復(fù)雜、形態(tài)多樣，出單一功能基因制備的疫苗遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能激發(fā)的宿主免疫反應(yīng)，難以達(dá)到較理想的抗蟲目的。因此，本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，將弓形蟲抗原P30與ROP2的基因構(gòu)建在同一原核表達(dá)載體上，并高效表達(dá)P30-ROP2融合蛋白，然后將重組子再克隆于真核表達(dá)載體pc-DNA3質(zhì)粒中，再插入HSP70基因，構(gòu)建出弓形蟲P30-ROP2-HSP70復(fù)合基因疫苗，為弓形蟲疫

4、苗的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論
　　 l抗弓形蟲多克隆抗體（兔血清）的制備
　　 方法：選5只體重2.2kg左右的健康家兔，取11mg弓形蟲抗原與弗氏完全佐劑(FCA)充分研磨混勻，分別注入家兔后肢胭窩淋巴結(jié)內(nèi)（每條后腿0.5ml左右，相當(dāng)于每只家兔2.0mg免疫抗原量）。每間隔2周，分別進(jìn)行第二、三次免疫，抗原量相同，接種部位改為兩處后背部皮下。第三次免疫前l(fā)天和免疫后2周、4周分

5、別耳靜脈或心臟采血，分離血清，以測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求后盡快心臟取血。
　　 結(jié)果：成功制備了弓形蟲多克隆抗體。第三次免疫前1天、第三次免疫后4周5只家兔血清中含弓形蟲抗體效價(jià)多為l：32萬(wàn)左右，第三次免疫后2周5只家兔血清中含弓形蟲抗體效價(jià)多為1：64萬(wàn)左右。
　　 結(jié)論：弓形蟲多克隆抗體的成功制備為后續(xù)的免疫學(xué)的研究打下了基礎(chǔ)。
　　 2弓形蟲P30-ROP2復(fù)合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

6、r>　　 方法：將液氮凍存的弓形蟲速殖子復(fù)蘇后，接種于小鼠腹腔，連續(xù)傳代三次，收集小鼠腹水，分離純化速殖子，常規(guī)方法提取基因組DNA。根據(jù)GenBank報(bào)道的P30基因和ROP2基因序列的開放讀碼框架分別設(shè)計(jì)合成引物；PCR法擴(kuò)增P30、ROV2基因片段，重疊PCR法擴(kuò)增P30-ROP2復(fù)合基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，克隆至TOPO-TA克隆載體；通過(guò)酶切、測(cè)序鑒定正確后，將P30-ROP2復(fù)合基因片段亞克隆至pET-30a(+)載

7、體，構(gòu)建成pET-30a-P30-ROP2質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，IPZG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)蛋白用SDS-PAGE初步分析，Westernblot分析鑒定。
　　 結(jié)果：提取弓形蟲基因組DNA;PCR擴(kuò)增出預(yù)期的P30片段(684bp)和ROP2片段(1212bp);成功構(gòu)建了TOPO-P30-ROP2質(zhì)粒，以及重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-P30-ROP2;測(cè)序結(jié)果表明：與GenBank報(bào)道的基因序列相比，P30基因

8、有1個(gè)堿基發(fā)生同義突變；ROP2基因有2個(gè)堿基不同，導(dǎo)致1個(gè)編碼氨基酸發(fā)生改變，但都沒有改變?cè)蛄械拈_放閱讀框架。pET30-P30-ROP2轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出了約75kDa的融合蛋白，Westernblot分析鑒定證實(shí)該重組蛋白能被兔血清多克隆抗體識(shí)別。
　　 結(jié)論：pET30a-P30-ROP2重組表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建、P30-ROP2重組蛋白的高效表達(dá)，為下步實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
　　

9、 3弓形蟲P30-ROP2-HSP70復(fù)合基因疫苗的構(gòu)建
　　 方法：重新設(shè)計(jì)帶有所需酶切位點(diǎn)的引物，以構(gòu)建成功pET30a-p30-ROP2質(zhì)粒為模板，PCR法擴(kuò)增P30-ROP2復(fù)合基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，克隆至TOPO-TA克隆載體。通過(guò)酶切、測(cè)序鑒定正確后，將P30-ROP2復(fù)合基因片段亞克隆至真核表達(dá)載體pc-DNA3，構(gòu)建成pc-DNA3-P30-ROP2質(zhì)粒。然后體外擴(kuò)增HSP70基因，插入pc-DNA

10、3-P30-ROV2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了TOPO-P30-ROP2質(zhì)粒、TOPO-NSP70質(zhì)粒以及真核表達(dá)質(zhì)粒pc-DNA3-P30-ROP2-HSP70。測(cè)序結(jié)果表明：與GenBank報(bào)道的基因序列相比，P30基因有1個(gè)堿基發(fā)生同義突變；ROP2基因有2個(gè)堿基不同和一個(gè)堿基缺失，導(dǎo)致1個(gè)編碼氨基酸發(fā)生改變和框移突變，經(jīng)補(bǔ)救措施修正了缺失的堿基，HSP70基因完全一致。<