鋅與鋅轉(zhuǎn)運體在脊髓和DGR的分布以及鋅在NPP中的作用和機制.pdf

1、鋅是哺乳動物體內(nèi)重要的微量元素之一，在機體的生長發(fā)育、生殖遺傳、免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)活動等重要生理過程中發(fā)揮重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，大約15％的鋅離子處于游離狀態(tài)，這些鋅離子主要位于含鋅神經(jīng)元(zinc—enriched neuron，ZEN)軸突末端的突觸小泡內(nèi)。當神經(jīng)活動時，游離鋅離子往往隨著一些神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而進入突觸間隙并與突觸后膜的某些受體結(jié)合或者穿越突觸后膜進入到突觸后神經(jīng)元，從而發(fā)揮其神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。近年來人們對鋅轉(zhuǎn)運體

2、(zinc transporters，ZNTs)的研究進一步揭示了鋅的生物學功能，ZNT7就是其中一個重要組成成員，它的功能是將鋅轉(zhuǎn)運到高爾基體內(nèi)，從而維持細胞內(nèi)的鋅穩(wěn)態(tài)。 神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是一種由神經(jīng)系統(tǒng)損傷而引起的慢性疾病，臨床上以痛覺過敏、觸誘發(fā)痛(或稱痛覺超敏)、局部感覺缺失以及自發(fā)性疼痛等為特點。近年來，隨著人口的老齡化，NPP的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但是由于缺乏有效的治療手段

3、，已經(jīng)成為危害人類健康的主要疾病之一。 基礎(chǔ)研究表明，鋅能影響NMDA和非NMDA受體的表達與功能，后者在傷害性刺激傳導中起重要作用；金屬硫蛋白—Ⅲ和游離鋅離子以及含鋅初級傳入神經(jīng)元在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)的大量分布也提示鋅可能參與痛覺的傳導。動物實驗顯示，脊神經(jīng)背根切斷術(shù)后，小鼠痛閾明顯降低，脊髓背側(cè)角淺層灰質(zhì)的鋅離子明顯減少，進一步證實鋅可能參與痛覺的產(chǎn)生和傳導。 因此，

4、本研究利用金屬自顯影技術(shù)(autometallography，AMG)、免疫組織化學、免疫熒光雙標記與共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)、Westein blot技術(shù)研究鋅及ZNTs在小鼠脊髓和DRG的分布。在此基礎(chǔ)上，利用坐骨神經(jīng)分支選擇損傷模型(spared nerve injury，SNI)觀察低鋅和高鋅預(yù)處理對SNI模型動物行為學變化以及脊髓和DRG中鋅離子、神經(jīng)肽、神經(jīng)元凋亡和星形膠質(zhì)細胞的影響，從而為探討脊髓和DRG中的鋅代謝以及鋅在

5、NPP產(chǎn)生與傳導中的作用和機制研究提供重要的實驗依據(jù)。 實驗方法： 應(yīng)用AMG技術(shù)、免疫組織化學技術(shù)、Western Blot技術(shù)檢測鋅和ZNT7在CD—1小鼠脊髓和DRG的分布，應(yīng)用免疫熒光雙標記和共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)檢測ZNT7與TGN38在小鼠脊髓和DRG的定位分布及其位置關(guān)系。建立SNI動物模型，利用觀察動物自主行為變化與行為學檢測技術(shù)對模型進行鑒定。在此基礎(chǔ)上，分別給予低鋅或高鋅預(yù)處理，觀察鋅預(yù)處理對SNI

6、模型動物行為學的影響。同時，利用AMG技術(shù)、N—(6—甲基—8—喹啉)—甲苯磺酰胺熒光染色技術(shù)(N—(6—methoxy—8—quinolyl)-Para-Toluenesulfonamide，TSQ)檢測鋅在各組模型動物脊髓和DRG的分布變化；利用免疫組織化學技術(shù)、Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測鋅預(yù)處理對SNI模型動物脊髓和DRG中的降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related protein，CG

7、RP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、細胞凋亡因子和星形膠質(zhì)細胞表達的影響。 實驗結(jié)果： 1、鋅離子在CD—1小鼠脊髓和DRG的分布 AMG陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黑色顆粒，主要分布在小鼠脊髓的神經(jīng)元軸突終末和DRG神經(jīng)元細胞核的周圍，呈斑塊狀或顆粒狀圍繞細胞核。 2、ZNT7在CD—1小鼠脊髓和DRG的分布 免疫組織化學結(jié)果顯示：ZNT7免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，在脊髓灰質(zhì)的神經(jīng)元

8、以及DRG神經(jīng)元的細胞核周圍均可見ZNT7陽性產(chǎn)物分布，呈斑塊狀或顆粒狀圍繞在細胞核周圍高爾基體的分布區(qū)域。 免疫熒光雙標記和共聚焦激光掃描結(jié)果顯示：在小鼠脊髓灰質(zhì)和DRG的神經(jīng)元細胞核周圍均有ZNT7陽性產(chǎn)物的表達，其與TGN38的分布相同，均呈斑塊狀或顆粒狀共分布于神經(jīng)元細胞核周圍。 3、ZNT7在CD—1小鼠脊髓內(nèi)表達的Western Blot分析 應(yīng)用Western Blot技術(shù)對小鼠脊髓內(nèi)ZNT7在蛋白

9、水平的表達進行檢測。結(jié)果顯示，小鼠的脊髓內(nèi)有ZNT7的豐富表達。 4、SNI模型的鑒定 觀察動物自主行為發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組(SHAM)術(shù)后第2天步態(tài)基本恢復正常，無甩足和舔足等自發(fā)痛行為；而SNI模型動物在術(shù)后第1天就開始跛行，術(shù)側(cè)后足不敢承重，出現(xiàn)甩足和舔足等自發(fā)痛行為，一直持續(xù)到觀察期末。 機械性痛閾檢測表明：與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾值相比，SHAM組術(shù)后痛閾無明顯下降，差異無顯著性意義(P>0.05)；SNI組術(shù)后痛閾明

10、顯下降，差異有顯著性意義(P<0.05)。與SHAM組相比，SNI組術(shù)后機械痛閾顯著降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，表明模型制備成功。 5、低鋅或高鋅預(yù)處理對SNI模型動物脊髓背側(cè)角和DRG中鋅離子的影響 AMG和TSQ檢測結(jié)果顯示：與SHAM組相比，正常動物模型組(N—SNI)與低鋅預(yù)處理組(L—SNI)的術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角淺層和DRG中的鋅離子均顯著減少(P<0.05)，其中L—SNI組比N—SNI組減少更為顯

11、著(P<0.05)；而高鋅預(yù)處理組(H—SNI)術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角淺層和DRG中的鋅離子均顯著增多(P<0.05)。 6、鋅對SNI模型動物行為學的影響 觀察動物自主行為發(fā)現(xiàn)：SHAM組術(shù)后第2天步態(tài)基本恢復正常，無舔足和甩足等自發(fā)痛行為；而N—SNI、L—SNI和H—SNI組在術(shù)后第1天就開始跛行，術(shù)側(cè)后足不敢承重，出現(xiàn)甩足、舔足等自發(fā)痛行為，一直持續(xù)到觀察期末。此外，L—SNI組小鼠的自主行為最為顯著，而H—SNI組的自

12、主行為相對較輕。 機械性痛閾檢測表明：與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾值相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術(shù)后痛閾均明顯下降，差異有顯著性意義(P<0.05)；與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術(shù)后機械性痛閾均降低，差異有顯著性意義(P<0.05)。其中，L—SNI組痛閾低于N—SNI組(P<0.05)，而H—SNI組痛閾高于N—SNI組(P<0.05)。 7、鋅對SNI模型脊髓背側(cè)角和DRG中CGRP和NPY

13、的影響 免疫組織化學結(jié)果顯示：CGRP和NPY陽性產(chǎn)物為棕褐色細顆粒狀。主要分布在術(shù)側(cè)的脊髓背側(cè)角淺層和DRG神經(jīng)元細胞質(zhì)中。與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組的陽性表達均顯著增高(P<0.05)。其中，L—SNI組的陽性表達高于N—SNI組(P<0.05)，而H—SNI組的陽性表達低于N—SNI組(P<0.05)。 8、鋅對SNI模型脊髓背側(cè)角神經(jīng)元凋亡的影響 免疫組織化學檢測結(jié)果表明：Ca

14、spases—3、Fas和FasL陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀，主要分布在脊髓背側(cè)角淺層的神經(jīng)元中。與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角Caspases—3、Fas和FasL陽性表達均增高(P<0.01)。L—SNI組的表達高于N—SNI組(P<0.01)；H—SNI組的表達低于N—SNI組(P<0.01)。 Westein blot檢測結(jié)果表明：與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組

15、術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角Caspases—3、Fas、FasL的陽性表達均顯著增高(P<0.01)。與N—SNI組相比，L—SNI組的陽性表達增多(P<0.01)；H—SNI組的陽性表達減少(P<0.01)。 9、鋅對SNI模型脊髓背側(cè)角GFAP表達的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性細胞呈綠色熒光，細胞多突起，胞體較小。SHAM組術(shù)側(cè)脊髓背

16、側(cè)角只有少量GFAP陽性細胞。與SHAM組相比較，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術(shù)側(cè)脊髓背側(cè)角的GFAP陽性細胞均增多(P<0.05)。與N—SNI組相比，L—SNI組的陽性細胞增多(P<0.05)，H—SNI組陽性細胞減少(P<0.05)。 結(jié)論： 1、正常小鼠脊髓和DRG中富含游離鋅離子和ZNT7。其中，ZNT7與高爾基復合體標記物TGN38的表達存在共區(qū)域性。 2、低鋅預(yù)處理能使SNI模型脊髓背側(cè)角淺