鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnTs在小鼠內(nèi)分泌細(xì)胞中的表達(dá)及ZnT8參與睪酮合成的分子機(jī)制.pdf

1、前言:
　　 鋅是哺乳動(dòng)物中含量第二豐富的微量元素，參與許多生物學(xué)功能，包括:生長(zhǎng)，發(fā)育，生殖，免疫等。鋅在人和動(dòng)物的新陳代謝中發(fā)揮重要作用，從生化學(xué)角度，鋅參與調(diào)控300多種酶，這些酶參與中間代謝，DNA和RNA合成，基因表達(dá)和免疫活性;從激素的穩(wěn)態(tài)角度，鋅也具有重要作用，鋅和幾乎所有的激素可以相互作用。密切相關(guān)的有:甲狀腺素，甲狀旁腺激素，胰島素，垂體激素，雄激素和雌激素等。鋅離子在胰島β細(xì)胞中高表達(dá)，并且在胰島素分泌小泡中

2、參與胰島素結(jié)晶，也參與垂體中催乳素和腎上腺皮質(zhì)激素的分泌。鋅缺乏使血清中甲狀腺素T3水平下降，同時(shí)抑制雄性激素和雌激素的合成與分泌。大量的研究表明，鋅同男性生殖的健康和疾病也有著密切的關(guān)系。睪酮的合成需要多種與鋅有關(guān)的酶的參與才能完成，在睪丸Leydig細(xì)胞中，睪酮是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化作用轉(zhuǎn)化而成的，細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)，3羥甾脫氫酶(3βHSD)，細(xì)胞色素P45017α-羥化酶(P450α17)和17

3、β-羥甾脫氫酶(17ββHSD)這4種酶是睪酮生成的基本酶。因而鋅缺乏可使睪酮合成減少，并且缺鋅對(duì)睪丸有特殊損害作用，鋅缺乏狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間質(zhì)細(xì)胞壞死，數(shù)量減少，影響Leydig細(xì)胞產(chǎn)生和分泌睪酮。缺鋅還可導(dǎo)致DNA、RNA聚合酶活性降低，DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成障礙，使細(xì)胞增殖受阻，膽固醇催化酶活性降低，也影響促性腺激素的分泌，睪酮及其運(yùn)輸載體蛋白的合成，最終導(dǎo)致睪酮合成障礙。
　　 鋅離子不能通過被動(dòng)擴(kuò)散跨越生物膜，在哺

4、乳動(dòng)物中由鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(ZnTsand Zips)來調(diào)節(jié)鋅離子的跨膜運(yùn)動(dòng)，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnT家族是一組具有六個(gè)跨膜區(qū)域并富含組氨酸的結(jié)構(gòu)和功能相近的蛋白質(zhì)，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外或者轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)細(xì)胞器中，從而達(dá)到降低胞內(nèi)鋅離子的作用。ZnT家族包含10個(gè)家族成員，即ZnT1-10，它們與鋅離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。ZnT家族的表達(dá)與分布具有組織特異性。近年研究表明，ZnT8主要定位于胰島β細(xì)胞的分泌囊泡膜上，由369個(gè)氨基酸組

5、成，是胰島的特異性鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其功能是特異性的向分泌囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子，使鋅離子在囊泡內(nèi)聚集，調(diào)節(jié)胰島素的合成、儲(chǔ)存和分泌。近期研究表明，ZnT8也表達(dá)在胰島α細(xì)胞和其他內(nèi)分泌細(xì)胞，包括甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞。ZnT8與內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能密切相關(guān)，這提示其他ZnTs是否也與內(nèi)分泌細(xì)胞密切相關(guān)。同時(shí)，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、3、7、8在男性生殖系統(tǒng)均有表達(dá)。此前的研究中證實(shí)小鼠睪丸中ZnT7表達(dá)廣泛，并且ZNT7和鋅離子分布在曲細(xì)精管內(nèi)

6、不同種類的細(xì)胞中。此前，研究中證實(shí)ZnT7將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)高爾基體，并可能參與了高爾基體對(duì)蛋白質(zhì)的修飾加工。這也提示與內(nèi)分泌密切相關(guān)的ZnT8是否與雄激素睪酮的合成和分泌具有相關(guān)性。
　　 睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成的睪酮是確保精子生成、維持正常性欲和雄性第二性征所必需的類固醇激素。大部分睪酮由睪丸的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，睪丸中的睪酮水平是血清中的睪酮水平的10倍。LH/hCG是調(diào)節(jié)睪酮生物合成的主要激素， LH/hCG調(diào)節(jié)睪酮合成包括快速

7、和慢性兩種作用方式。LH/hCG刺激LH受體30-60分鐘后，導(dǎo)致cAMP的水平快速和慢性上升，隨后PKA被激活，激活的PKA信號(hào)誘導(dǎo)EGFP非依賴性配體所導(dǎo)致的MAPK信號(hào)通路的激活。MAPK的激活導(dǎo)致現(xiàn)有的少量StAR磷酸化和轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜，引起類固醇的生成增多。但是LH/hCG調(diào)節(jié)睪酮合成的快速作用機(jī)制目前還不是很清楚。在慢性調(diào)節(jié)期，間質(zhì)細(xì)胞需要LH/hCG保持其完全分化的結(jié)構(gòu)和功能，2小時(shí)之后，慢速PKA信號(hào)導(dǎo)致StAR的mR

8、NA轉(zhuǎn)錄水平升高，隨后StAR蛋白表達(dá)增高，MAPK的顯著信號(hào)不再引起StAR磷酸化和轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜。StAR蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory Protein，類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白)是調(diào)節(jié)這一步驟的關(guān)鍵性因子。文獻(xiàn)證實(shí)，幼年及成年小鼠或者大鼠注射生理劑量的LH/hCG后，可誘發(fā)血清睪酮濃度上升。體外原代培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，給予LH/hCG刺激后，可分泌睪酮，并在一定范圍內(nèi)，分泌睪酮量與LH/hCG的

9、濃度呈正相關(guān)。
　　 綜上所述，鋅在內(nèi)分泌細(xì)胞中豐富表達(dá)，為深入探討鋅在內(nèi)分泌細(xì)胞中鋅穩(wěn)態(tài)的內(nèi)在機(jī)制和ZnTs在內(nèi)分泌細(xì)胞中的表達(dá)與分布，并驗(yàn)證鋅和ZnTs與相關(guān)激素的合成和分泌的相關(guān)作用。本研究以CD1小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)鋅和ZnT1-10在小鼠垂體、腎上腺、甲狀腺、胰腺、睪丸和卵巢中的表達(dá)和分布;同時(shí)本實(shí)驗(yàn)旨在探討ZnT8介導(dǎo)的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)參與hCG誘導(dǎo)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮生成的影響及其機(jī)制，并進(jìn)一步驗(yàn)證ZnT8介導(dǎo)睪酮的

10、生成是通過快速通路還是慢性通路，以及鋅及ZnT8影響睪酮合成時(shí)所作用的相關(guān)酶，從而揭示ZnT8參與類固醇激素合成過程中的證據(jù)及機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、鋅和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnTs在小鼠內(nèi)分泌細(xì)胞中的表達(dá)與分布的研究
　　 28只CD1小鼠（8-10周，重約30克，雄性14只，雌性14只），應(yīng)用金屬自顯影(AMG, autometallography)檢測(cè)zinc在具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰

11、腺，睪丸和卵巢）中的分布。應(yīng)用Real time PCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)ZnTs mRNA和蛋白在上述具有內(nèi)分泌功能的器官中的表達(dá)和分布。
　　 2、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnT8參與睪酮分泌的分子機(jī)制研究
　　 雄性CD1乳鼠（15天，重約9克）給予hCG處理后，應(yīng)用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)ZnT8與StAR在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)與分布;應(yīng)用AMG和免疫組化技術(shù)等檢測(cè)hCG對(duì)乳鼠血清睪酮濃度，睪丸間質(zhì)細(xì)胞鋅離子，ZnT8表達(dá)的影響

12、。小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞（MLTC-1）給予高鋅、低鋅、ZnT8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾處理后，檢測(cè)孕酮水平，cAMP，PKA活性的水平，以及鋅離子分布的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)ZnT8、StAR和P-StAR以及睪酮合成過程快速通路和慢性通路中的酶的表達(dá)，以及cAMP-PKA途徑和MAPK通路中的相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、鋅和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnTs在小鼠內(nèi)分泌細(xì)胞中的表達(dá)
　

13、　 1、ZnT1-10 mRNA在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的表達(dá)
　　 Real time PCR結(jié)果顯示，ZnT1-10 mRNA在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，甲狀腺，胰腺，腎上腺，睪丸和卵巢）中均有表達(dá)，但是表達(dá)含量不同，只有ZnT10 mRNA在胰腺中沒有表達(dá)。ZnT1 mRNA在垂體和甲狀腺中高表達(dá)，在胰腺表達(dá)量最低。ZnT2 mRNA在垂體和卵巢中表達(dá)量相對(duì)最低。ZnT

14、3 mRNA的表達(dá)量在甲狀腺和睪丸中較高，在垂體，胰腺，腎上腺和卵巢中表達(dá)量極低，幾乎檢測(cè)不到。ZnT4 mRNA和ZnT6 mRNA在檢測(cè)的器官中表達(dá)情況相似，甲狀腺和睪丸中高表達(dá)，ZnT4 mRNA在卵巢中次之，也高于其他器官，其余器官的表達(dá)水平相似，而ZnT6 mRNA在垂體和卵巢中表達(dá)高于胰腺和腎上腺。ZnT5 mRNA表達(dá)量在垂體，甲狀腺，胰腺，睪丸，腎上腺和卵巢中依次遞減。ZnT7 mRNA在睪丸中表達(dá)最高，垂體和胰腺次之，

15、在其余器官中低表達(dá)。ZnT8 mRNA的表達(dá)水平在胰腺中最高，在其他的內(nèi)分泌器官也有表達(dá)，但是表達(dá)水平顯著低于胰腺。ZnT9mRNA豐富表達(dá)在垂體和卵巢，高于其他器官的表達(dá)水平。ZnT10 mRNA在被檢測(cè)器官中的表達(dá)水平最低，低于其他的ZnTs mRNA，ZnT10 mRNA在垂體中相對(duì)高表達(dá)，在胰腺中不表達(dá)。
　　 2、ZnT1-10蛋白在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的分布
　　

16、 (1) ZnTs蛋白在腺垂體中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在腺垂體的嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞胞質(zhì)中，ZnT3-5和ZnT8在嫌色細(xì)胞中也有陽(yáng)性反應(yīng)，但是ZnT1，ZnT2與ZnT7只有微弱陽(yáng)性染色或陰性的反應(yīng)。
　　 (2) ZnTs蛋白在腎上腺中的分布
　　 所有的ZnTs均在腎上腺中表達(dá)，ZnT1，ZnT3，ZnT4，ZnT7和ZnT8分布在腎上腺皮質(zhì)的球狀帶

17、，束狀帶和網(wǎng)狀帶細(xì)胞中，ZnT2，ZnT5和ZnT10在球狀帶的陽(yáng)性反應(yīng)較弱，ZnT1，ZnT3，ZnT7和ZnT8在腎上腺髓質(zhì)中高表達(dá)，ZnT4，ZnT5和ZnT10在腎上腺髓質(zhì)中呈陰性反應(yīng)。
　　 (3) ZnTs蛋白在甲狀腺中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和濾泡旁細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
　　 (4) ZnTs蛋白在胰腺中的分布
　　 除了Z

18、nT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白在胰島細(xì)胞胞質(zhì)中均呈陽(yáng)性免疫反應(yīng)，但是ZnT3的免疫染色較弱。
　　 (5) ZnTs蛋白在睪丸中的分布
　　 所有的ZnTs均表達(dá)在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)，ZnT7也高表達(dá)在曲細(xì)精管中的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。
　　 (6) ZnTs蛋白在卵巢中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8高表達(dá)在不同時(shí)期卵泡細(xì)胞中的顆粒細(xì)胞，所有的Zn

19、Ts在卵巢黃體中均有強(qiáng)烈的免疫陽(yáng)性染色反應(yīng)。
　　 3、zinc在小鼠具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中的表達(dá)
　　 AMG實(shí)驗(yàn)表明在所檢測(cè)的內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有棕褐色的AMG陽(yáng)性產(chǎn)物，表明zinc分布在腺垂體細(xì)胞，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和濾泡旁細(xì)胞，胰島細(xì)胞，睪丸間質(zhì)細(xì)胞，曲細(xì)精管，卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞和黃體。二、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnT8參與睪酮分泌的分子機(jī)制研究
　　 1、

20、免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中共定位。
　　 ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中共定位。
　　 2、ZnT8參與hCG誘導(dǎo)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮生成。
　　 hCG處理乳鼠后，乳鼠血清睪酮濃度升高，睪丸間質(zhì)細(xì)胞鋅離子聚集增多，ZnT8蛋白表達(dá)水平增多，同時(shí)刺激了StAR蛋白的產(chǎn)生。
　　 3、ZnT8介導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞（MLTC-1）的鋅

21、離子轉(zhuǎn)運(yùn)
　　 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(MLTC-1)給予高鋅、低鋅、hZnT8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和mZnT8 siRNA干擾處理后，觀察到高鋅組和ZnT8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞所分泌的孕酮水平升高，低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組孕酮水平降低，并且這種變化與hCG處理時(shí)間呈正比。同時(shí)，TSQ熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示hCG處理組，高鋅組和ZnT8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組使MLTC-1細(xì)胞中鋅離子聚集增多，而低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組使鋅

22、聚集減少。
　　 4、證實(shí)ZnT8介導(dǎo)睪酮的生成是通過快速通路還是慢性通路。
　　 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞（MLTC-1）給予高鋅、低鋅、hZnT8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和mZnT8 siRNA干擾處理后，Western blot結(jié)果顯示快速通路中P-StAR蛋白在高鋅組和ZnT8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表達(dá)升高，總StAR蛋白在各組間沒有變化;慢性通路中總StAR，3β-HSD和P450scc均在低鋅組表達(dá)降低，這說明ZnT8介導(dǎo)睪酮

23、的生成是通過快速通路。
　　 5、不同處理因素對(duì)MLTC-1細(xì)胞中cAMP-PKA途徑和P-ERK1/2表達(dá)水平的影響。
　　 不同處理因素組對(duì)MLTC-1細(xì)胞的cAMP和PKA水平引起變化，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Western blot結(jié)果顯示P-ERK1/2蛋白在高鋅組和ZnT8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表達(dá)升高，低鋅組和mZnT8 siRNA干擾組P-ERK1/2蛋白水平降低，同時(shí)在不同處理因素后應(yīng)用ERK抑制劑PD98059

24、，孕酮水平的變化被PD98059所抑制，說明ZnT8在快速通路中通過激活ERK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)StAR的磷酸化參與睪酮合成的分子機(jī)制。
　　 結(jié)論:
　　 1、在具有內(nèi)分泌功能的器官（垂體，腎上腺，甲狀腺，胰腺，睪丸和卵巢）中
　　 (1) ZnT1-10 mRNA均有表達(dá)，但是表達(dá)含量不同，ZnT10 mRNA在胰腺中沒有表達(dá)。
　　 (2) ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白也均有表達(dá)，含量及組織