肝損傷萃取物對不同物種BMSCs分化方向的影響及微囊包被技術(shù)初探.pdf

1、干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是當(dāng)前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)問題。骨髓間質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)是一類具有多向分化潛能的均質(zhì)性成體干細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)條件下可向不同胚層的細(xì)胞分化，如：骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等。近年來，向肝系細(xì)胞分化的研究越來越受到人們的關(guān)注。本實驗的前期研究已成功實現(xiàn)了由骨髓間質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，證實了肝損傷組織萃取物對骨髓干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)活性，并初步揭示了肝損傷組織萃取物的分子基礎(chǔ)。研究顯示，肝損傷組織萃取

2、物內(nèi)可能包含有骨髓間質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化所需的信息分子。然而，上述研究都是以大鼠模型為基礎(chǔ)的，研究發(fā)現(xiàn)的大鼠肝損傷組織萃取物的生物學(xué)活性是否對其他物種也起作用?換言之，大鼠肝損傷組織萃取物的干細(xì)胞定向誘導(dǎo)活性是否具有物種廣譜性?對于評估肝損傷組織萃取物的潛在應(yīng)用價值以及是否有進(jìn)一步研究開發(fā)的必要性，無疑具有十分重要的意義。 如上所述，我們已實現(xiàn)了由骨髓間質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，并經(jīng)動物實驗證明這些骨髓源肝細(xì)胞能夠代償衰竭的肝

3、臟功能，可作為細(xì)胞移植和生物反應(yīng)器研制的細(xì)胞源。然而，如何解決免疫隔離問題則是我們必須跨越的技術(shù)屏障。文獻(xiàn)分析顯示，ACA微囊比較適合細(xì)胞移植和生物反應(yīng)器對免疫隔離的要求。因此，能否利用海藻酸鈉和殼聚糖等材料成功地制作出ACA微囊、微珠等細(xì)胞載體?能否實現(xiàn)微囊/微珠與細(xì)胞的成功結(jié)合?如何提高微囊/微珠內(nèi)細(xì)胞的存活率并保持其生物活性?若能解決這一系列技術(shù)問題，對于細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展及生物反應(yīng)器的研制無疑具有十分重要的意義?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)

4、狀以及本研究組前期的工作結(jié)果，本實驗擬采用大鼠肝損傷組織萃取物分別對源自大鼠、人和新西蘭兔的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以觀察不同物種來源的細(xì)胞對大鼠肝損傷組織萃取物的應(yīng)答能力，從而判斷大鼠肝損傷組織萃取物對骨髓間質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)活性是否具有物種廣譜性。同時，為了解決細(xì)胞移植所引起的免疫隔離問題我們初步探索了．ACA微囊/微珠技術(shù)，為細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展及生物反應(yīng)器的研制做必要的準(zhǔn)備。 實驗方法： 一、肝損傷萃取物對不同物種BMS

5、Cs分化方向的影響： 1.肝損傷大鼠模型的構(gòu)建及肝組織萃取物的制備選取SD大鼠為實驗動物，以2-AAF/CCl4程序構(gòu)建肝損傷動物模型。取動物肝臟，制備肝組織萃取物。 2.肝組織萃取物生物活性的鑒定以肝組織萃取物作為刺激物對大鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實驗，根據(jù)BMSCs誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)特征以及分子表達(dá)譜特征(分化狀態(tài))確認(rèn)肝組織萃取物的生物活性。 3.三個物種BMSCs的獲取和培養(yǎng)。

6、4.利用同批次相同誘導(dǎo)強(qiáng)度的肝損傷萃取物誘導(dǎo)液同時對三個不同物種的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。 5.分別在第5、7、10和20天收集誘導(dǎo)中的細(xì)胞，并拍照記錄下不同時間的形態(tài)特征。 6.利用RT—PCR技術(shù)分析不同物種在不同誘導(dǎo)時間的分子表達(dá)譜。 二、微囊包被技術(shù)初步探索： 1.利用自制微囊制備儀制備微載體，在倒置相差顯微鏡下觀察微載體的形態(tài)。 2.掃描電鏡觀察微球和微珠表面超微結(jié)構(gòu)。 3.嘗試

7、模擬滾動培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)載細(xì)胞微珠，并觀察不同培養(yǎng)方式下微珠內(nèi)細(xì)胞生長活性和細(xì)胞形態(tài)。 實驗結(jié)果： 1.三個物種BMSCs在誘導(dǎo)過程中形態(tài)學(xué)變化十分相似。在誘導(dǎo)的第5天見一部分短梭形細(xì)胞變?yōu)轭悎A形細(xì)胞(圖3—4)，且細(xì)胞生長速度明顯減慢；誘導(dǎo)第10天，類圓形細(xì)胞逐漸變?yōu)槎嘟切晤惿掀有螒B(tài)，細(xì)胞灶狀分布逐漸凸顯，導(dǎo)第20天，灶狀分布的類上皮樣細(xì)胞十分明顯，呈簇狀緩慢生長，中央?yún)^(qū)域細(xì)胞多角形明顯(人BMSCs變化更為明顯)。

8、 2.大鼠、人和新西蘭兔BMSCs在肝損傷組織萃取物的誘導(dǎo)下第5天開始表達(dá)幼稚肝細(xì)胞的標(biāo)記M2-PK和GST-P，而在繼續(xù)誘導(dǎo)第20天幼稚肝細(xì)胞的標(biāo)記消失，同時大鼠BMSCs轉(zhuǎn)而開始表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)記Albumin；在第10、20天骨髓源性標(biāo)記BST-1逐漸消失。這種分化跡象從始至終在對照組沒有發(fā)現(xiàn)，并始終保持骨髓源細(xì)胞特有的標(biāo)志分子BST-1。注：新西蘭兔則因基因信息缺乏致數(shù)據(jù)缺失。 3.微珠/微囊大小均一、平均直徑為0

9、.8mm左右，規(guī)則圓形，表面光滑，透明，并具有一定強(qiáng)度；載細(xì)胞微珠形態(tài)大小和表面結(jié)構(gòu)與空載微珠完全相同，但微珠內(nèi)可見分布均勻的細(xì)胞；載細(xì)胞微囊為大小均勻，平均直徑約為1m，規(guī)則圓形，囊壁完整；培養(yǎng)24h后載細(xì)胞微囊內(nèi)壁可見貼壁細(xì)胞貼于微囊囊壁生長，貼壁細(xì)胞形態(tài)與生長活性和培養(yǎng)瓶二維培養(yǎng)細(xì)胞基本相同。 4.掃描電鏡示：500倍下微球表面凹凸不平伴有圓形突起，突起之間的平坦區(qū)為表面平滑的皺褶，100000倍下皺褶表面平滑。殼聚糖外膜

10、的微珠500倍下可見粗糙表面伴有凹凸不平的球形隆起，100000倍下每個大顆粒表面為分布均勻的形狀大小均細(xì)的珊瑚狀或小顆粒結(jié)構(gòu)組成。 5.微珠在靜置培養(yǎng)5天后仍保持一定存活率，同種培養(yǎng)方式下，細(xì)胞存活率的下降趨勢是固定的，滾動培養(yǎng)在短時間內(nèi)可以保持較高的存活率；使用培養(yǎng)基更適合做靜置培養(yǎng)。載細(xì)胞微囊靜置培養(yǎng)10天后仍保持較強(qiáng)存活率。 結(jié)論： 1.使用大鼠肝損傷萃取物同時對大鼠、人和新西蘭兔BMSCs的誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn)

11、，三個物種的BMSCs均能對大鼠肝損傷萃取物的誘導(dǎo)刺激作出應(yīng)答反應(yīng)，分別在刺激的第5，7，10天表達(dá)幼稚肝細(xì)胞的分子標(biāo)志M2-PK和GST-P(新西蘭兔BMSCs僅表達(dá)M2-PK)。表明大鼠肝損傷萃取物對骨髓干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)活性具有物種廣譜性，有必要進(jìn)一步研究開發(fā)。 2.由于誘導(dǎo)實驗的各項參數(shù)是依據(jù)大鼠設(shè)定，誘導(dǎo)實驗的第20天，僅見大鼠BMSCs表達(dá)albumin，人BMSCs未見表達(dá)，可能與刺激強(qiáng)度不足或刺激時間不夠所致。

12、新西蘭兔則因albumin基因信息缺乏致數(shù)據(jù)缺失。 3.以自制微囊制備儀制作的海藻酸鈉微球、ACA微珠和ACA微囊直徑在0.8mm左右，大小均一，形狀規(guī)則，超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)明顯，初步達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。 4.ACA．微珠/微囊與細(xì)胞結(jié)合實驗顯示，細(xì)胞能在微珠內(nèi)存活7天左右而在微囊可以存活10天以上。表明ACA微珠和微囊具有較好的半透性，可作為細(xì)胞載體。 5.自制微囊制備儀制作的ACA微珠和微囊直徑偏大，表面積較小，距實際應(yīng)