誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞對(duì)百草枯所致肺損傷的保護(hù)作用及一氧化氮的作用.pdf

1、[目的]百草枯(Paraquat)作為一種除草劑在世界廣泛應(yīng)用，但百草枯有毒性，嚴(yán)重中毒可引起急性肺損傷，其死亡率高達(dá)45％以上[4-5]。目前，百草枯所致急性肺損傷尚無有效的治療措施。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）具有多向分化潛能及低免疫原性等優(yōu)勢(shì)，可用于損傷疾病的治療。然而，iPSC對(duì)肺損傷是否具有保護(hù)作用尚不清楚。
　　iPSC移植方式日益受到研究者的關(guān)注，已有報(bào)道證實(shí)在損傷組織局部注射iPSC一方面減輕組織損傷，另一方面引起

2、畸胎瘤的發(fā)生[28-29]；經(jīng)動(dòng)脈定向給予細(xì)胞移植雖然降低了畸胎瘤的發(fā)生，但是實(shí)際操作具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性[28]。因此，如何有效的輸注iPSC到體內(nèi)發(fā)揮作用，并避免畸胎瘤的形成是我們首要解決的問題。本課題組前期工作已證實(shí)經(jīng)靜脈給予iPSC移植后的正常小鼠，并未形成畸胎瘤。進(jìn)而，我們需要進(jìn)一步確定，在百草枯繼發(fā)肺損傷模型中，經(jīng)尾靜脈給予iPSC降低畸胎瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
　　NO系一氧化氮合酶（NOS）的產(chǎn)物，是一種重要的血管保護(hù)因子[2

3、3]，參與調(diào)控細(xì)胞的粘附、遷移、生長、增殖、凋亡、分化等生物學(xué)功能[24-25]。我們推測(cè)NO可能通過調(diào)控iPSC的生物學(xué)功能，對(duì)百草枯繼發(fā)肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
　　【方法】80只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為4組，百草枯實(shí)驗(yàn)組，iPSC(PKH26染色為紅色熒光)治療組，L-Arg預(yù)處理iPSC治療組和L-Name預(yù)處理iPSC治療組。小鼠腹腔注射百草枯水溶液(14mg/kg)建立肺損傷模型后，分別于4h,24h經(jīng)尾靜脈注射PB

4、S，iPSC，L-Arg預(yù)處理的iPSC和L-Name預(yù)處理的iPSC給與治療。于治療后第3天和第28天經(jīng)尾靜脈給予FITC標(biāo)記的BSA，并在30分鐘后收集各組小鼠肺組織、肺泡灌洗液（BALF）。HE染色檢測(cè)損傷肺組織病理變化，Masson染色觀察損傷肺組織纖維化病變，烘干法檢測(cè)損傷肺組織濕/干（W/D），測(cè)定BALF中的細(xì)胞和BSA熒光強(qiáng)度，PCR檢測(cè)肺損傷組織中iPSC的含量，蛋白印記檢測(cè)損傷肺組織中VCAM-1和膠原蛋白-1蛋白水

5、平的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)促炎因子IL-1β、IL-6，以及抗炎因子IL-10 mRNA水平的表達(dá)，NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺損傷組織中NO的含量，免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀察iPSC在肺損傷組織中的定位及分化。
　　此外，在該小鼠模型，于腹腔注射百草枯溶液后4h，一次性給予iPSC治療（細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/只），3個(gè)月后，經(jīng)Micro PET-CT掃描觀察是否有畸胎瘤的形成。
　　【結(jié)果】經(jīng)Micro PET-CT掃

6、描觀察，模型小鼠在給予iPSC（5×106個(gè)/只）治療3個(gè)月后，未發(fā)現(xiàn)有畸胎瘤形成。急性肺損傷期，給予 iPSC治療后，損傷肺組織的炎癥反應(yīng)較PBS治療組明顯減輕，損傷區(qū)域的炎癥細(xì)胞數(shù)也較PBS治療組下調(diào)了約65%；BALF中BSA的熒光強(qiáng)度同比降低了約65%，炎癥細(xì)胞數(shù)減少了約80%；肺損傷組織的W/D下調(diào)了約65%。給予iPSC治療后，肺損傷組織中IL-1β、IL-6、 IL-10的表達(dá)水平分別下調(diào)了70%~80%、80%~90%、

7、85%，VCAM-1蛋白表達(dá)量下調(diào)了65%，膠原含量減少80%，膠原蛋白-1蛋白表達(dá)量下調(diào)了約20%~40%，明顯減輕肺損傷區(qū)域的纖維沉積。經(jīng)L-Arg預(yù)刺激的iPSC治療后，進(jìn)一步加強(qiáng)了iPSC的治療效果，而經(jīng)L-NAME預(yù)刺激的iPSC治療后，拮抗了iPSC的治療效果。
　　檢測(cè)肺損傷組織中NO含量，結(jié)果顯示，給予iPSC治療后，肺損傷組織中的NO含量上調(diào)了60%，L-Arg預(yù)刺激的iPSC治療后，肺損傷組織中的NO含量較 i

8、PSC治療后上調(diào)了大約30%,而L-Name預(yù)刺激的iPSC治療后，肺損傷組織中的NO含量較 iPSC治療后則下調(diào)了大約20%。
　　肺損傷區(qū)可見PKH26標(biāo)記的iPSC，可以與DAPI染色的細(xì)胞核有共定位；特異性肺泡I型上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白： Podoplanin/gp36和特異性肺泡II型上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白：SP-C與帶有紅色熒光的iPSC有共定位，表明，這些iPSC已經(jīng)分化為肺泡I型上皮細(xì)胞和肺泡II型上皮細(xì)胞。
　　【結(jié)論