調(diào)控人羊膜上皮細(xì)胞AQP3表達(dá)的cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、目的:在前期研究中，發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞水通道蛋白3(AQP3)的表達(dá)與羊水量異常相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制未明。通過(guò)研究調(diào)控人羊膜上皮細(xì)胞AQP3表達(dá)的環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，明確人羊膜上皮細(xì)胞中AQP3表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為臨床上治療羊水量異常提供新思路。
　　 方法:(1)體外原代培養(yǎng)足月妊娠羊水量正常的人羊膜上皮細(xì)胞。(2)分別用①cAMP激動(dòng)劑Forskolin處理人羊膜上皮細(xì)胞，不同濃度Forsko

2、lin(0、2.5、5、50、100μmol/L)作用2h和最佳濃度Forskolin不同作用時(shí)間(0、1、2、10、20h)。同時(shí)加入等量的DMS0作為溶劑對(duì)照組。②PKA激動(dòng)劑SP-cAMP處理人羊膜上皮細(xì)胞，不同濃度SP-cAMP(0、2.5、5、50、100μmol/L)作用2h和最佳濃度SP-cAMP不同作用時(shí)間(0、1、2、10、20h)。③PKA抑制劑H-89處理人羊膜上皮細(xì)胞，不同濃度H-89(0、5、10、50、100

3、μmol/L)作用2h和最佳濃度H-89不同作用時(shí)間(0、1、2、10、20h)。以上①②③不同作用時(shí)間組設(shè)置空白對(duì)照，不同濃度組采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。④最佳濃度的Forskolin+最佳濃度H-89處理人羊膜上皮細(xì)胞2h。(3)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定Forskolin、SP-cAMP和H-89作用前后人羊膜上皮細(xì)胞內(nèi)cAMP含量及PKA活性表達(dá)變化。(4)采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)AQP3蛋白在人羊膜上皮細(xì)胞

4、中的定位。(5)采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)人羊膜上皮細(xì)胞中總CREB、磷酸化CREB(p-CREB)和AQP3蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:(1)免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法發(fā)現(xiàn)AQP3蛋白表達(dá)于人羊膜上皮細(xì)胞的胞漿及胞膜，以胞漿為主，F(xiàn)orskolin、SP-cAMP和H-89不同濃度和不同時(shí)間作用后，AQP3表達(dá)定位未見(jiàn)明顯變化。(2)不同濃度Forskolin、SP-cAMP和H-89作用人羊膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖率無(wú)顯著性差異。(3)空

5、白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)cAMP含量、PKA活性、總CREB、p-CREB和AQP3蛋白表達(dá)在不同作用時(shí)間均未見(jiàn)顯著性差異。(4) cAMP含量、PKA活性、p-CREB和AQP3蛋白表達(dá)，在5μmol/L Forskolin作用2h組較0μmol/L作用2h組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;最佳濃度Forskolin作用10h組比0h組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？侰REB表達(dá)在各濃度組和各時(shí)間組均無(wú)顯著性差異。(5) PKA活性、p-CREB和A

6、QP3蛋白表達(dá)，在SP-cAMP50μmol/L作用2h組較0μmol/L作用2h組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;最佳濃度SP-cAMP作用10h組比0h組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。cAMP含量及總CREB表達(dá)在各濃度組和各時(shí)間組均無(wú)顯著性差異。(6)PKA活性、p-CREB和AQP3蛋白表達(dá)，在H-8910μmol/L作用2h組較0μmol/L作用2h組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;最佳濃度H-89作用2h組較0h組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義。cAMP含量及總CREB表達(dá)在各濃度組和各時(shí)間組均無(wú)顯著性差異。(7) Forskolin+H-89處理人羊膜上皮細(xì)胞2h后，p-CREB和AQP3蛋白表達(dá)較Forskolin處理組明顯下調(diào)，但高于H-89處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？侰REB表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　　 結(jié)論:(1) AQP3蛋白表達(dá)于人羊膜上皮細(xì)胞的胞漿及胞膜，以胞漿為主。(2)Forskolin能夠上調(diào)人羊膜上皮細(xì)胞中cAMP含量、PKA活性、p-CRE

8、B表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)人羊膜上皮細(xì)胞中AQP3蛋白的表達(dá)水平，提示Forskolin可能通過(guò)激活cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)節(jié)人羊膜上皮細(xì)胞中AQP3蛋白表達(dá)水平。(3)SP-cAMP能夠上調(diào)人羊膜上皮細(xì)胞中PKA活性、p-CREB表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)人羊膜上皮細(xì)胞中AQP3蛋白的表達(dá)水平，提示SP-cAMP可能通過(guò)激活PKA途徑來(lái)調(diào)節(jié)人羊膜上皮細(xì)胞中AQP3蛋白表達(dá)水平。(4)H-89能夠下調(diào)入羊膜上皮細(xì)胞中PKA活性、p-CREB表