法尼醇對白念珠菌cAMP-PKA信號通路作用的研究.pdf

1、目的:白念珠菌耐藥現象出現而導致念珠菌感染下降的治愈率引起越來越多人們的關注，而法尼醇可以增加多種微生物對藥物的易感性。本研究探討法尼醇對白念珠菌浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)對氟康唑藥物的易感性影響;通過構建白念珠菌耐藥株闡明法尼醇對白念珠菌標準株及耐藥株生物被膜狀態(tài)cAMP-PKA信號通路的調控作用及其與耐藥的相關性。
　　方法:
　　實驗一:實驗分為法尼醇處理白念珠菌浮游組，生物被膜組以及各自法尼醇未處理對照組。采用XTT檢測

2、吸光光度值大小從而分析法尼醇處理對白念珠菌浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)對氟康唑藥物易感性的差異。
　　實驗二:研究菌株為:白念珠菌標準株及利用白念珠菌標準株誘導的白念珠菌耐藥株。實驗分組如下:法尼醇處理白念珠菌標準株生物被膜，法尼醇未處理白念珠菌標準株生物被膜，法尼醇處理白念珠菌耐藥株生物被膜及法尼醇未處理白念珠菌耐藥株生物被膜組。提取白念珠菌生物被膜全RNA，實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測法尼醇對白念珠菌不同生物被膜時相cAMP

3、-PKA信號通路相關基因Ras1，Gpa2，Cap1，Sgt1，Cyr1，Pde1，Pde2，Pka1，Bcy1，Tpk2，fg1表達的調控作用;提取白念珠菌生物被膜蛋白質，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測法尼醇對cAMP-PKA通路RAS1，CYR1，PDE2，BCY1蛋白表達的作用。
　　結果:
　　實驗一:XTT結果顯示:浮游狀態(tài)的白念珠菌對氟康唑的易感性是白念珠菌生物被膜狀態(tài)的8～61倍(P＜0.001

4、)。同法尼醇未處理浮游狀態(tài)白念珠菌相比，法尼醇處理后的浮游狀態(tài)白念珠菌對氟康唑的敏感性無明顯改變（P＞0.05）。同法尼醇未處理生物被膜狀態(tài)白念珠菌相比，法尼醇處理后生物被膜狀態(tài)白念珠菌對氟康唑的敏感性增高（P＜0.05)。
　　實驗二:q-PCR結果:
　　法尼醇處理標準株組同法尼醇未處理標準株組比較:在生物被膜形成6h，Ras1，Cap1，Sgt1，Cyr1，Pde1，Pka1，Bcy1，Tpk2，fg1表達下調，Pde

5、2表達上調，其余基因表達無明顯改變;在12 h,Ras1基因表達下調，Cap1，Cyr1，Pde1，Pde2，Pka1，Bcy1，Tpk2基因表達上調，其余基因表達無明顯改變;在24 h，Ras1，Cyr1基因表達下調，Pka1，Pde1，Pde2基因表達上調，其余基因表達無明顯改變;在36h，Ras1，Cyr1基因表達下調，Pka1基因表達上調，其他基因表達無明顯改變。其中，法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6h，12h，24 h和36

6、h表達均下調，Pde2在生物被膜6h，12h和24 h表達均上調，在生物被膜36 h表達沒有明顯改變，Cyr1在生物被膜6h,24h和36h表達均下調，在生物被膜12h表達上調(P＜0.01)。
　　法尼醇處理耐藥株組同法尼醇未處理耐藥株組比較:在生物被膜6h，Ras1，Pka1，Bcy1，Tpk2表達下調，Cap1，Pde1，Pde2基因表達上調，其余基因無明顯改變;在12h，Ras1，Sgt1基因表達下調，Cyr1，Pde2,

7、Pka1，Bcy1基因表達上調，其余基因無明顯改變;在24 h，Ras1，Cap1基因表達下調，Pde1，Pde2，Bcy1基因表達上調，其余基因無明顯改變.在36 h，Ras1，Cyr1，Pde2基因表達下調，Cap1，Pka1，Bcy1，Tpk2,Efg1基因表達上調，其余無基因明顯改變。其中，法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6h，12h，24 h和36 h表達均下調，Pde2在生物被膜6，12和24 h表達均上調，在生物被膜36

8、h表達下調，Cyr在生物被膜12 h表達上調，在生物被膜36h表達下調，在其余時間沒有明顯改變(P＜0.01）。
　　耐藥株與標準株比較:在生物被膜6 h,Pde1，Pde2表達下調，Cyr1，Tpk2表達上調，其余基因無明顯改變;在12 h，Pde1，Pde2基因表達下調，Cyr1，Tpk2基因表達上調，其余無基因明顯改變;在24 h，Cyr1，Tpk2,Efg1基因表達上調，其余基因無明顯改變;在36h，Sgt1，Pde1，P

9、de2基因表達下調，Bcy1基因表達上調，其余基因無明顯改變。其中，法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6h，12h，24 h和36 h表達均無明顯改變，Pde2在生物被膜6h，12h和36 h表達均上調，在生物被膜24 h表達無明顯改變，Cyr1在生物被膜6h，12h和24 h表達上調，在生物被膜36h表達沒有明顯改變（P＜0.01）。
　　Western Blot結果顯示:
　　法尼醇處理標準株組同法尼醇未處理標準株組比較:

10、在生物被膜6h，RAS1，CYR1，BCY1蛋白表達水平下調，PDE2蛋白表達水平上調;在12h，RAS1表達水平下調，CYR1，PDE2，BCY1表達水平均上調;在24 h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達水平均下調;在36h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達水平均下調。其中，法尼醇作用蛋白RAS1在生物被膜6h，12h，24 h和36h表達均下調，PDE2在6h和12h表達上調，在24 h和36h表達下調，CYR

11、1在6h，24 h和36 h表達下調，在12h表達上調。
　　法尼醇處理耐藥株組同法尼醇未處理耐藥株組比較:在生物被膜6h，RAS1，CYR1，BCY1蛋白表達水平下調，PDE2蛋白表達水平上調;在12h，RAS1表達水平下調，CYR1，PDE2，BCY1表達水平均上調;在24 h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達水平均下調;在36h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達水平均下調。其中，法尼醇作用蛋白RAS1在生

12、物被膜6h，12h，24 h和36h表達均下調，PDE2在6h和12h表達上調，在24 h和36 h表達下調，CYR1在6h，24 h和36 h表達下調，在12h表達上調。
　　耐藥株組與標準株組比較:在生物被膜6h，RAS1，BCY1，CYR1表達水平無明顯改變，PDE2表達水平下調;在12h，RAS1，BCY1，CYR1表達水平無明顯改變，PDE2表達水平下調;在24 h，RAS1，BCY1，PDE2表達水平無明顯改變，CYR

13、1表達上調;在36h，RAS1，BCY1，PDE2表達水平無明顯改變，CYR1表達上調。其中，法尼醇作用蛋白RAS1在生物被膜6h，12h，24 h和36 h表達均無明顯改變，PDE2在6h和12 h表達下調，在24 h和36 h表達沒有明顯改變，CYR1在24 h和36h表達上調，在6h和12h表達沒有明顯改變。
　　結論:
　　實驗一:浮游狀態(tài)下白念珠菌對氟康唑的藥物易感性遠高于生物被膜狀態(tài)。法尼醇對浮游狀態(tài)和生物被膜狀

14、態(tài)白念珠菌的藥物易感性的作用不同:法尼醇未改變浮游狀態(tài)白念珠菌對氟康唑的藥物易感性;法尼醇增高了生物被膜狀態(tài)的白念珠菌對氟康唑的藥物易感性。
　　實驗二:法尼醇對白念珠菌生物被膜的調控作用與生物被膜形成時相相關，不同生物被膜時相法尼醇調控的基因蛋白及其表達存在差異。法尼醇可能通過調控cAMP-PKA信號通路耐藥分子的表達影響白念珠菌生物被膜的耐藥性。法尼醇對cAMP-PKA信號通路的調節(jié)作用是一個雙向的，根據不同生物被膜時相，它的