cAMP-PKA信號通路在樹突狀細(xì)胞影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面的作用.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)是宿主機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中的一員，它是一種高效的抗原提呈細(xì)胞，可感知和捕獲外界刺激，決定宿主是否啟動免疫防御以及啟動何種免疫防御，DC對機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)可通過一定的信號通路。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)是一種免疫抑制細(xì)胞，在平衡免疫反應(yīng)和免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其穩(wěn)態(tài)可以受到DC的調(diào)節(jié)。但具體通過怎樣的分子途徑仍然未知。
　　本研究利用PKA調(diào)節(jié)亞單位

2、R1αf/f小鼠模型和Cbl-b-/-C-cblf/f小鼠模型，構(gòu)建了R1α和Cbl-b/C-cbl在DC細(xì)胞中條件性敲除小鼠，結(jié)果證實，DC中cAMP/PKA信號通路和Cbl信號通路均在其調(diào)節(jié)Treg穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，并在此基礎(chǔ)上深入研究cAMP/PKA信號通路在DC中的作用，及其調(diào)節(jié)Treg穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。
　　1 cAMP/PKA和Cbl信號通路均參與樹突狀細(xì)胞對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響
　　為研究DC影響Treg穩(wěn)態(tài)可以通過

3、哪條信號通路，我們利用實驗室現(xiàn)有R1αf/f小鼠模型和Cbl-b-/-C-cb1f/f小鼠模型，構(gòu)建了他們在DC細(xì)胞中的敲除小鼠。DC敲除R1α，PKA中R亞單位失去了對C亞單位的抑制，從而模擬了cAMP/PKA信號通路的激活。敲除小鼠的DC在淋巴結(jié)和脾臟中均出現(xiàn)顯著性增殖，脾臟的DC甚至出現(xiàn)了一群特殊的MHCⅡhiCD11clow DC，由于跟淋巴結(jié)中遷移DC相似，我們稱之為S2DC。
　　DC中敲除Cbl-b/C-cbl，盡管

4、敲除小鼠脾臟中cDC的比例和數(shù)量沒有變化。但CD8+DC和CD11b+DC的比例卻發(fā)生了逆轉(zhuǎn):WT小鼠CD8+DC&CD11b+DC比例大約為2:7;而cbl-b-/-C-cblDCKO小鼠的比例則正好相反，幾乎為7∶2。更重要的是，這兩種敲除小鼠淋巴器官中的Treg均出現(xiàn)顯著性增殖。這說明cAMP/PKA信號通路和Cbl信號通路在DC細(xì)胞在調(diào)節(jié)Treg的穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮一定作用。
　　2 cAMP/PKA信號通路在樹突狀細(xì)胞中激活對

5、其自身發(fā)育和功能的影響
　　病原菌的感染與宿主免疫密不可分。我們以R1αDCKO小鼠為工具，著重研究了cAMP/PKA信號通路在DC調(diào)節(jié)Treg穩(wěn)態(tài)中的機(jī)制。在病原引起宿主免疫防御的研究中具有一定意義。上一章的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，小鼠的DC細(xì)胞中cAMP/PKA信號通路激活，會導(dǎo)致DC細(xì)胞在淋巴器官內(nèi)聚集，與此同時，敲除小鼠的Treg也在淋巴器官內(nèi)出現(xiàn)了廣泛性增殖。這說明cAMP/PKA信號通路在DC細(xì)胞調(diào)節(jié)Treg的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮一定作用

6、。本章旨在研究cAMP/PKA信號通路在DC中激活對其本身發(fā)育和功能的影響。由于R1αDCKO小鼠淋巴器官中的DC增殖，而淋巴器官中DC的來源可能有2種，一是在骨髓發(fā)育中產(chǎn)生，通過血液循環(huán)到達(dá)淋巴器官;二是外周非淋巴器官的DC通過淋巴管道遷移至淋巴器官。我們首先發(fā)現(xiàn)，骨髓中DC的前體細(xì)胞preDC在WT和R1αDCKO小鼠中無顯著性差別。另外，體外FLT-3L培養(yǎng)DC在WT和R1αDCKO小鼠中也無顯著性差別，這說明DC增殖的原因并不是

7、因為其在發(fā)育過程中生成的更多。
　　外周非淋巴組織中的DC在收到諸如炎癥等“危險信號”后，會向淋巴器官移動。在這個過程中，DC成熟，趨化因子受體CCR7的表達(dá)量會升高。這說明CCR7在DC遷移功能中具有關(guān)鍵性作用。經(jīng)流式細(xì)胞檢測，R1αDCKO小鼠皮膚cDC比例下降至WT小鼠的1/3，同時，皮膚和脾臟中CCR7的表達(dá)量都顯著性高于WT小鼠。提示cAMP/PKA信號通路激活可能模擬了DC受到“危險信號”，因此上調(diào)CCR7的表達(dá)，從而

8、使得大量的外周非淋巴組織中DC遷移至淋巴器官，并聚集于此，脾臟甚至形成S2DC。
　　3 R1α基因敲除小鼠的樹突狀細(xì)胞可通過cAMP/PKA信號通路影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)
　　上一章已經(jīng)證實DC中活化cAMP/PKA信號通路，可上調(diào)趨化因子受體CCR7的表達(dá)使得外周非淋巴組織的DC大量向淋巴器官聚集。本章旨在研究DC是如何影響Treg增殖的，是直接調(diào)節(jié)還是間接調(diào)節(jié)？以及這個調(diào)節(jié)與信號通路cAMP/PKA之間的關(guān)系。我們首先

9、觀察到R1αDCKO小鼠具有高水平的IL-2的生成。而IL-2是Treg產(chǎn)生和增殖所需最重要的一種細(xì)胞因子。體內(nèi)封閉IL-2的產(chǎn)生可以使R1αDCKO小鼠脾臟中增殖的Treg出現(xiàn)下降。這說明R1αDCKO小鼠脾臟中增殖的Treg依賴IL-2的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)R1αDCKO小鼠中過量的IL-2是由于CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生過多引起的。而CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2是由于受到了抗原的刺激。體外抗原提呈實驗證實，R1αDCKO小鼠的S2DC具有更

10、強(qiáng)的抗原提呈能力，從而刺激了相應(yīng)的OTⅡ CD4+T細(xì)胞分泌更多的IL-2。這是因為R1αDCKO小鼠的S2DC表達(dá)更高的MHCⅡ水平。MHCⅡ是DC提呈抗原給CD4+T細(xì)胞的必要分子結(jié)構(gòu)。體外封閉S2DC的MHCⅡ表達(dá)可以抑制S2DC的抗原提呈能力，并抑制IL-2的產(chǎn)生。
　　綜上所述，DC中cAMP/PKA信號通路激活，如同受到“危險信號”指令，因此上調(diào)CCR7的表達(dá)，使外周非淋巴組織DC向淋巴器官遷移，使脾臟聚集了一群MHC

11、ⅡhiDC，這群DC有更強(qiáng)的抗原提呈能力，能夠刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-2，引起Treg穩(wěn)態(tài)失調(diào)，表現(xiàn)為大量的增殖。
　　4生理狀態(tài)下的樹突狀細(xì)胞可通過cAMP/PKA信號通路影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)
　　DC除了在受到外界病原菌感染過程中可通過cAMP/PKA信號通路影響Treg穩(wěn)態(tài)，在正常生理狀態(tài)下也可以通過cAMP/PKA信號通路調(diào)節(jié)Treg。紫外線照射是一種正常的生理現(xiàn)象。它作為一種普遍的外環(huán)境刺激可影響抗原提

12、呈細(xì)胞的功能。DC則是皮膚上最主要的抗原提呈細(xì)胞。研究證實，紫外線照射會影響皮膚DC在皮膚上的分布，從而影響下游的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)活化Treg。這說明DC是可以影響Treg穩(wěn)態(tài)的。本課題通過紫外線照射小鼠模型，成功模擬出了DC遷移和Treg的增殖。有意思的是，紫外線照射引起DC的遷移是即刻發(fā)生的，而引起Treg的增殖則是需要時間的累積，這提示Treg的增殖可能是受DC遷移的影響而繼發(fā)產(chǎn)生的。與此同時，體內(nèi)適應(yīng)性轉(zhuǎn)移的Treg也可以在紫外線

13、照射的小鼠模型中出現(xiàn)增殖，這說明DC是可以直接影響Treg穩(wěn)態(tài)的。盡管DC可調(diào)節(jié)Treg近年來已被多種實驗證實，然而具體調(diào)節(jié)的機(jī)制仍不清楚。機(jī)體感知外界信號需要通過一定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。經(jīng)研究證實，紫外線照射皮膚，可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的前列腺素E2(pGE2)。pGE2是通過結(jié)合其在細(xì)胞膜上的G蛋白耦連受體EP傳遞信號刺激。而EP又在cAMP/PKA途徑的上游，這提示紫外線照射產(chǎn)生pGE2是通過cAMP/PKA途徑。
　　為研究紫外線

14、照射引起皮膚DC遷移，引流淋巴結(jié)Treg增殖是通過cAMP/PKA途徑。我們在實驗室建立的紫外線照射小鼠模型中封閉了小鼠體內(nèi)pGE2的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)受到紫外線照射增殖的Treg在封閉了pGE2后得到了部分下降，這就第一次證明紫外線照射引起DC遷移和Treg的增殖是可以部分通過cAMP/PKA途徑。
　　5（國內(nèi)研究部分）豬鏈球菌2型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Tran功能的研究
　　豬鏈球菌2型是一種重要的人畜共患病病原。豬鏈球菌病的爆發(fā)不但給

15、養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還可感染人類具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)研究意義。本課題以我國豬群中廣泛流行的豬鏈球菌2型(SS2)豬源ZY05719株為研究對象，前期通過抑制性差減雜交鑒定出可能與SS2毒力相關(guān)的新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Tran，通過構(gòu)建敲除突變株△tran，對該基因進(jìn)行深入研究。結(jié)果表明與野毒株相比，敲除株生長速率緩慢，粘附能力減弱，斑馬魚毒力下降。此外，利用基因芯片的分析手段，進(jìn)一步明確了tran在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的功能。芯片結(jié)果分析表明

16、tran基因的敲除導(dǎo)致細(xì)菌全基因組中的130個基因發(fā)生差異性表達(dá)，其中上調(diào)基因21個及下調(diào)基因109個，基因功能涵蓋編碼各類蛋白酶及核酸酶，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)組分，熱休克蛋白，ATP結(jié)合蛋白，膜蛋白等多種功能基因。芯片結(jié)果已被qRT-PCR驗證。在所有發(fā)生差異性表達(dá)的基因中最主要是編碼糖代謝有關(guān)的酶類和熱休克蛋白家族，這提示Tran在調(diào)控細(xì)菌自身糖代謝和抵抗外界宿主環(huán)境應(yīng)激能力方面具有重要作用。而這也被后續(xù)實驗所證實。綜上所述，tran不僅

17、僅是毒力相關(guān)因子，且作為調(diào)控基因在整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)層面對SS2致病力產(chǎn)生重要影響。
　　豬鏈球菌感染宿主，可引起宿主先天性免疫和適應(yīng)性的免疫反應(yīng)。盡管其中的分子機(jī)制仍不清楚，但豬鏈球菌鑒定出來許多毒力因子都與感染中和宿主的相互作用有關(guān)。莢膜多糖CPS可以抵抗宿主免疫細(xì)胞的吞噬，是最重要的毒力因子。最近研究發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌表面的腺苷酸合成酶Ssads也可能是一種毒力相關(guān)因子。它可將宿主細(xì)胞中的核苷酸轉(zhuǎn)化成腺苷酸。一旦腺苷酸在細(xì)胞內(nèi)累計，可