miR-184對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSCs)是一類具有增殖和多向分化能力的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物中，NSCs主要存在于側(cè)腦室的腦室下區(qū)(SVZ)及海馬的顆粒細(xì)胞下層(SGZ)，研究表明NSCs具有再生及修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能，但目前仍不十分清楚NSCs增殖及定向分化機(jī)制，因此有必要進(jìn)一步探究NSCs的增殖分化機(jī)制。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約18～22 nt小單鏈RNA分子，通過(guò)m

2、iRNA5'端與其靶分子mRNA3'端的UTR序列特異互補(bǔ)結(jié)合后，對(duì)mRNA起負(fù)調(diào)控作用。成熟miR-184在細(xì)胞內(nèi)的主要表達(dá)形式為單鏈miR-184-3P，目前對(duì)miR-184在神經(jīng)組織細(xì)胞中的作用少有研究。
　　本研究通過(guò)構(gòu)建pHBLV-U6-miR-184/miR-184-shRNA-ZsGreen基因過(guò)表達(dá)及干擾慢病毒載體，并感染體外培養(yǎng)的NSCs，使miR-184在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)或沉默，進(jìn)而探究miR-184對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增

3、殖分化的影響以及miR-184與Notch信號(hào)通路相互作用的分子機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.構(gòu)建miR-184基因過(guò)表達(dá)及干擾慢病毒載體;
　　2.探究miR-184在NSCs中的目標(biāo)靶基因;
　　3.研究miR-184對(duì)NSCs增殖分化的影響及其分子機(jī)制;
　　4.研究miR-184與Notch信號(hào)通路在NSCs增殖分化時(shí)的相互作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出

4、miR-184基因和miR-184 shRNA基因，并分別克隆到pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen質(zhì)粒載體中，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體。分離培養(yǎng)孕14天的胎鼠腦室下區(qū)（SVZ區(qū)）的神經(jīng)干細(xì)胞并鑒定。
　　2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為過(guò)表達(dá)對(duì)照組、miR-184過(guò)表達(dá)組、干擾對(duì)照組和miR-184干擾組，每組分別感染對(duì)應(yīng)的慢病毒，并用終濃度為3μg/mL的嘌呤霉素，進(jìn)行抗性篩選，收集各組存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至3代。通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，

5、進(jìn)行miR-184過(guò)表達(dá)驗(yàn)證。
　　3.采用Brdu細(xì)胞滲入實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，記錄各組Brdu+/DAPI+的比例。用神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)液培養(yǎng)各組NSCs，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)NSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞的情況，記錄MAP2+/DAPI+比例。并檢測(cè)NeuN蛋白和NeuN mRNA表達(dá)水平，以及Notch通路相關(guān)蛋白Hes1、Hes5及其mRNA表達(dá)水平。
　　4.通過(guò)targetScan、iRTarBase、miRan

6、da等軟件預(yù)測(cè)到Numbl作為miR-184的潛在靶基因，經(jīng)Western blotting法及RT-qPCR法進(jìn)行NSCs胞內(nèi)靶基因驗(yàn)證，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建pHBLV-U6-miR-184/miR-184-shRNA-ZsGreen慢病毒表達(dá)載體。免疫熒光結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞90％呈Nestin和Sox2雙陽(yáng)性。
　　2.細(xì)胞成功感染慢病毒，抗性篩選培養(yǎng)后，細(xì)胞

7、生長(zhǎng)良好，RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-184過(guò)表達(dá)組的miR-184相對(duì)表達(dá)量是過(guò)表達(dá)對(duì)照組的67.63±7.53倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.Brdu細(xì)胞滲入實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比較，miR-184過(guò)表達(dá)組Brdu+/DAPI比例是過(guò)表達(dá)對(duì)照組的1.47±0.05倍，MAP2+/DAPI+比例是過(guò)表達(dá)對(duì)照組的0.88±0.03倍，而與干擾對(duì)照組相比較，miR-184干擾組Brdu+/DAP

8、I+比例是干擾對(duì)照組的0.84±0.03倍，MAP2+/DAPI+比例是干擾對(duì)照組的1.18±0.03倍。與過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，miR-184過(guò)表達(dá)組的NeuN蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，分別是過(guò)表達(dá)對(duì)照組的0.76±0.02倍、0.75±0.07倍，而與干擾對(duì)照組相比較，miR-184干擾組則明顯升高，分別是干擾對(duì)照組的1.22±0.01倍、1.54±0.05倍，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與各自對(duì)照組比較，miR-

9、184過(guò)表達(dá)組Hes1、Hes5蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，miR-184干擾組則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.通過(guò)iRTarBase和miRanda等軟件，預(yù)測(cè)到Numbl是miR-184潛在的靶基因。與過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比較，miR-184過(guò)表達(dá)組的Numbl蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，是過(guò)表達(dá)對(duì)照組的0.73±0.07倍。與干擾對(duì)照組相比較，miR-184干擾組Numbl蛋白相對(duì)表達(dá)量則升高，是干擾