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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
牙病或外傷等原因引起的牙齒缺失可導(dǎo)致牙槽骨萎縮、相鄰牙齒松動(dòng)脫落等癥狀,直接降低人們的生活質(zhì)量和影響容貌美觀(guān)?;顒?dòng)義齒、固定義齒和種植義齒是最常見(jiàn)的修復(fù)缺失牙齒方法,然而他們各有弊病。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)成功地應(yīng)用組織工程技術(shù)研制出具有生物活性的牙齒部分組織,選擇合適的細(xì)胞團(tuán)或種子細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)牙齒再生重建的前提。牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)是牙髓組織中具有高度增殖、自我更新能力和
2、多相分化潛能的一類(lèi)成體干細(xì)胞。DPSCs體外培養(yǎng)可分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞,并分泌牙本質(zhì)或牙本質(zhì)樣物質(zhì),復(fù)合到支架材料上可形成牙本質(zhì)-牙髓樣組織。DPSCs作為組織工程的種子細(xì)胞之一,對(duì)牙齒的修復(fù)再生及牙齒組織工程相關(guān)研究具有重要意義。
Gronthos等將人的第三磨牙牙髓進(jìn)行原代培養(yǎng),分離DPSCs并將其置于含礦化液的培養(yǎng)液中,待形成礦化結(jié)節(jié)后將其與羥基磷灰石-磷酸三鈣(HA-TCP)支架復(fù)合,再將其移植到免疫缺陷小鼠的背部皮下
3、,6周后內(nèi)形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)環(huán)繞在牙髓樣組織周?chē)纬裳辣举|(zhì)牙髓樣復(fù)合體。研究表明,影響DPSCs增殖分化的因素包括堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形成蛋白(bone orphogeneticproteins,BMPs)、β-磷酸甘油、Dentonin等等。牙乳頭細(xì)胞也是組織工程牙齒的一類(lèi)種
4、子細(xì)胞。牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體是形成牙齒的前體。而牙乳頭內(nèi)含有向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的前體細(xì)胞,即牙乳頭細(xì)胞可以作為牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的前身。Kikuchi等研究表明牙乳頭中存在能分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞。另有研究表明體外培養(yǎng)的牙乳頭細(xì)胞不僅可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞,還可以誘導(dǎo)形成成牙本質(zhì)基質(zhì)。增強(qiáng)種子細(xì)胞的增殖活性和分化能力是構(gòu)建組織工程牙齒、推動(dòng)牙齒再生研究的重要條件。DPSCs和牙乳頭細(xì)胞在適宜的誘導(dǎo)環(huán)境中增殖能力和礦化能力均較強(qiáng),均有分化成
5、牙本質(zhì)細(xì)胞的潛能,而牙乳頭細(xì)胞在體外與DPSCs分層混合培養(yǎng)對(duì)DPSCs增殖、分化能力的影響目前還未見(jiàn)報(bào)道。
DPSCs的增殖、分化受Notch、Wnt等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)。Notch途徑是一種進(jìn)化高度保守的細(xì)胞間信號(hào)途徑,主要作用是抑制各種干細(xì)胞的分化,促進(jìn)其分裂增殖。研究表明,Notch信號(hào)分子通過(guò)和Delta或Jagged結(jié)合,影響DPSCs的增殖和分化,參與上皮細(xì)胞與問(wèn)充質(zhì)細(xì)胞間的通訊聯(lián)系,促進(jìn)成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞
6、的分化。Wnt信號(hào)通路在牙齒發(fā)育的信號(hào)調(diào)控和牙齒再生等醫(yī)學(xué)工程研究中亦發(fā)揮重要作用。Wnt信號(hào)中的重要因子wnt-1,APC,β-catenin,E-cadherin可影響牙上皮和間充質(zhì)的相互作用及牙本質(zhì)與牙根的發(fā)育、增殖和分化。
本研究擬分離培養(yǎng)大鼠DPSCs與牙乳頭細(xì)胞,并建立DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)體系,探討大鼠牙乳頭細(xì)胞對(duì)DPSCs增殖及分化的影響及相關(guān)牙齒發(fā)育信號(hào)通路的機(jī)制研究。此研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。我們
7、首先建立DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)體系,觀(guān)察體外分層共培養(yǎng)的細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況,并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DPSCs的細(xì)胞周期,利用RT-PCR、免疫細(xì)胞熒光化學(xué)方法、Western blot檢測(cè)牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、角蛋白(cytokeratin,CK)、Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ,COLⅠ)等基因與蛋白的表達(dá),觀(guān)察分層共培養(yǎng)是否能促進(jìn)這些成牙標(biāo)志性蛋白的表達(dá)。明確
8、牙乳頭細(xì)胞是否可以促進(jìn)DPSCs的增殖、分化,從而促進(jìn)其成牙能力。最后研究DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)下,給予Notch信號(hào)通路抑制劑異硫氰酸苯已酯(PHI)和Wnt信號(hào)通路抑制劑Dickkopf-1(DKK-1)干預(yù)DPSCs,檢測(cè)DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ基因和蛋白的表達(dá)。并觀(guān)察細(xì)胞中Notch、Wnt信號(hào)通路中的信號(hào)分子Notch1、Notch2、Jagged1、wnt-1,APC,β-catenin基因和蛋白的表
9、達(dá)變化。本研究結(jié)果能夠明確大鼠牙乳頭細(xì)胞是否促進(jìn)DPSCs的增殖與分化及其分子機(jī)制,這為牙齒再生的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。
方法:
1、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)。
2、von Kossa礦化染色。
3、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DPSCs的細(xì)胞周期。
4、利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ蛋白的表達(dá)。
5、RT-PCR法檢測(cè)DPSCs中DSPP
10、、CK、ColⅠ mRNA的表達(dá)。
6、Western blot法檢測(cè)DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ蛋白的表達(dá)。
7、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)下,給予Notch信號(hào)通路抑制劑PHI和Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK-1干預(yù)DPSCs,RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)。
8、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)下,RT-PCR法和
11、Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Notch信號(hào)通路中Notch1,Notch2,Jagged1,DLL1,Hes1 mRNA和蛋白表達(dá)。
9、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)下,RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Wnt信號(hào)通路中wnt-1,APC,β-catenin,E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)。
結(jié)果:
1、分層共培養(yǎng)14天后,DPSCs中可觀(guān)察到明顯的礦化結(jié)節(jié)。
12、 2、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示分層共培養(yǎng)可促進(jìn)DPSCs的增殖。
3、分層共培養(yǎng)細(xì)胞5天后,DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA的表達(dá)顯著增加。
4、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)下,給予PHI和DKK-1干預(yù)DPSCs,RT-PCR法和Western blot法結(jié)果顯示DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下降。
5、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的分層共培養(yǎng)下,RT-PCR法和W
13、estern blot法顯示細(xì)胞Notch信號(hào)通路中Notch1,Notch2,DLL1,Jagged1,Hes1 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
6、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞的混合培養(yǎng)下,RT-PCR法和Western blot法顯示細(xì)胞Wnt信號(hào)通路中wnt-1,β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng);E-cadherin,APCmRNA和蛋白表達(dá)和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
討論:
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠牙乳頭
14、細(xì)胞和DPSCs分層共培養(yǎng)14天后,DPSCs中可觀(guān)察到明顯的礦化結(jié)節(jié),分層共培養(yǎng)組細(xì)胞的增殖較單純DPSCs培養(yǎng)對(duì)照組增殖顯著旺盛,即牙乳頭細(xì)胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可促進(jìn)DPSCs的增殖。利用RT-PCR、免疫細(xì)胞熒光化學(xué)方法、Western blot證實(shí)了牙乳頭細(xì)胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可增加成牙標(biāo)志性蛋白DSPP、CK、COLⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)。該結(jié)果首次證明牙乳頭細(xì)胞可以促進(jìn)DPSCs的增殖、分化,從而促進(jìn)其成牙能力。同
15、時(shí)本研究結(jié)果顯示給予Notch信號(hào)通路抑制劑PHI和Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK-1干預(yù)DPSCs,DSPP、CK、ColⅠ基因和蛋白的表達(dá)減弱,提示Notch和Wnt信號(hào)通路可能參與了牙乳頭細(xì)胞促進(jìn)DPSCs的增殖、分化。本研究結(jié)果并進(jìn)一步明確牙乳頭細(xì)胞可能促進(jìn)Notch信號(hào)通路中的信號(hào)分子Notch1,Notch2,DLL1,Jagged1,Hes1及Wnt信號(hào)通路中的信號(hào)分子wnt-1,β-catenin表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)DPSCs的增殖
16、與分化。
恒牙出現(xiàn)缺損缺失時(shí),需要以人工修復(fù)體恢復(fù)口腔功能和面容美觀(guān)。隨著生物組織工程技術(shù)的進(jìn)步,人們開(kāi)始設(shè)想如何對(duì)牙齒能夠進(jìn)行生物克隆或再生,干細(xì)胞理論、組織重組以及生物支架材料的應(yīng)用,使人們有了希望去實(shí)現(xiàn)牙齒再生。2000年Gronthos等人成功的從人牙髓組織中提取出具有克隆源性且能快速增殖的DPSCs細(xì)胞群,將其種植于免疫缺陷小鼠的體內(nèi),可以培養(yǎng)出牙本質(zhì)牙髓樣物質(zhì)。
綜上所述,本研究結(jié)果證明大鼠牙乳頭細(xì)胞和D
17、PSCs分層共培養(yǎng),牙乳頭可能分泌一些可溶性因子促進(jìn)DPSCs的增殖、礦化與分化,并增加成牙標(biāo)志性蛋白DSPP、CK、COLⅠ mRNA和蛋白的表達(dá);Notch和Wnt信號(hào)通路可能參與了牙乳頭細(xì)胞促進(jìn)DPSCs的增殖、分化的過(guò)程。
結(jié)論:
1、牙乳頭細(xì)胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可促進(jìn)DPSCs礦化、增殖及分化
2、牙乳頭細(xì)胞和DPSCs分層共培養(yǎng)可促進(jìn)DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)
18、。
3、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞分層共培養(yǎng)時(shí)可能通過(guò)激活Notch、Wnt信號(hào)通路,促進(jìn)DPSCs的增殖、分化。
4、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞分層共培養(yǎng)時(shí)可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路中Notch1,Notch2,DLL1,Jagged1,Hes1 mRNA和蛋白表達(dá)促進(jìn)DPSCs的增殖、分化。
5、DPSCs和牙乳頭細(xì)胞分層共培養(yǎng)時(shí)可能通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路wnt-1,β-catenin mRNA促進(jìn)DPSC
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