EHECO157:H7部分蛋白的原核表達(dá)純化及免疫學(xué)特性研究.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩97頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  腸出血性大腸桿菌O157:H7(EHEC O157:H7)是全球食源性疾病的主要病原之一,自從1982年被報(bào)道作為一種腸道致病菌以來(lái),已經(jīng)在我國(guó)以及世界范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)流行,散發(fā)病例更是經(jīng)常見(jiàn)諸各種臨床雜志和報(bào)道。EHEC O157:H7感染對(duì)人類(lèi)健康和食品行業(yè)都帶來(lái)了明顯的經(jīng)濟(jì)損失。由于尚未有預(yù)防或者特殊的治療方式,了解EHEC O157:H7如何感染宿主及其致病方式對(duì)于避免EHEC O157:H7的暴發(fā)和改進(jìn)治療

2、方式將有重要意義,對(duì)有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)治療創(chuàng)新藥物、設(shè)計(jì)治療方案、研制有效疫苗、制定預(yù)防控制措施具有重要的理論指導(dǎo)作用。大腸桿菌引起感染主要取決于其毒力因子,目前研究報(bào)道較多的有緊密黏附素(Intimin)及緊密黏附素受體(Tir)和III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白。EHEC O157:H7通過(guò)III型分泌系統(tǒng)將其毒力蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞內(nèi),與宿主細(xì)胞發(fā)生作用,介導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白聚集,引起粘附與擦拭(A/E)損傷。但是此過(guò)程中具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至今尚不

3、清楚。了解引起粘膜擦拭損傷相關(guān)的蛋白,對(duì)闡明EHEC O157:H7的致病機(jī)制有重要的意義。
  本研究的目的是對(duì)預(yù)測(cè)的EHEC O157:H7 III型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白進(jìn)行逐級(jí)篩選鑒定,對(duì)篩選出的Z2322、Z2340等7個(gè)蛋白基因進(jìn)行克隆表達(dá)及純化,并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),分析成功表達(dá)純化的Z2322、Z2340等5個(gè)蛋白在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,進(jìn)一步明確其刺激小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類(lèi)型(Th1/Th2),為研究Z232

4、2、Z2340等5個(gè)蛋白在EHEC O157: H7的致病機(jī)制中的作用以及為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
  方法:
  以EHEC O157: H7 EDL933菌株基因組為基礎(chǔ),用LipoP等七個(gè)在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)Z2322、Z2340等7個(gè)蛋白是否含有信號(hào)肽、是否可能為內(nèi)膜蛋白或者外膜蛋白、預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位并分析其核苷酸序列的保守性。以EHEC O157:H7 EDL933菌株基因組為模板對(duì)Z2322、Z2340等7個(gè)蛋白的

5、基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)引入酶切位點(diǎn) BamHI和 XhoI,目的基因雙酶切后的回收產(chǎn)物分別與pET-22b(+)等四個(gè)表達(dá)載體相連,轉(zhuǎn)化到E. Coli BL21(DE3)中,在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白,并對(duì)融合蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行鑒定。將成功表達(dá)的蛋白用Ni親和柱進(jìn)行純化并制備鼠抗蛋白血清,采用 ELISA方法檢測(cè)蛋白的免疫原性。將免疫的小鼠分別在21、28、35、42天尾靜脈采血收集血清,ELISA檢測(cè)IgG抗體及其亞型(I

6、gG1、IgG2a、IgG3)的效價(jià),分析其刺激小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類(lèi)型(Th1/Th2)。將免疫后的小鼠用EHEC O157:H7 EDL933株進(jìn)行攻毒,檢測(cè)蛋白對(duì)小鼠的保護(hù)性。在攻毒后每日采集小鼠糞便檢測(cè)其活菌排菌量,確定蛋白對(duì)細(xì)菌定植的影響。
  結(jié)果:
  1.通過(guò)LipoP、Lipo、SignalP4.1軟件預(yù)測(cè),Z2322、Z2340、Z2354、Z2691、Z3074、Z3322和Z3955蛋白不存在信號(hào)肽。經(jīng)

7、預(yù)測(cè)軟件TmHmm和Bomp分析,這些蛋白不存在α-螺旋和β-桶狀結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位軟件 PSORTb3.0.2和CELLO v.2.5分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白可能分泌至細(xì)胞外,且通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些蛋白核苷酸序列保守性較高。
  2.成功克隆 Z2322、Z2340等七個(gè)預(yù)測(cè)蛋白基因片段并構(gòu)建出重組質(zhì)粒,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)出E.coli BL21-pET-28a-Z2691、E.coli BL21-pET-30a-Z2322

8、等10個(gè)重組蛋白。其中E.coli BL21-pET-28a-Z2691等5個(gè)蛋白在上清中表達(dá),為可溶性蛋白;E.coli BL21-pET-30a-Z2322等5個(gè)蛋白以包涵體的形式表達(dá)在沉淀中。
  3.用不同的方法分別純化可溶性蛋白和包涵體蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白分子量大小與預(yù)期一致。ELISA方法檢測(cè)Z2322、Z2340、Z2691、Z3322和Z3955抗血清的效價(jià),Z2340、Z2691和Z3955為6250

9、0EU,Z2322為12500EU,Z3322為2500EU。Z2322、Z2340、Z2691、Z3322能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生的以Th2型免疫占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答,Z3955能刺激機(jī)體產(chǎn)生以Th1型免疫占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。
  4.免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)顯示,Z2340、Z2691和Z3955、Z2322能降低小鼠死亡率對(duì)其產(chǎn)生較好的保護(hù)作用,Z3322能延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間,對(duì)其產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。這與ELISA方法檢測(cè)各蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的抗血

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論