肝復(fù)康和丹參對肝纖維化wnt經(jīng)典通路的影響.pdf

1、目的:
　　wnt/β-catenin是一種能維持組織器官穩(wěn)態(tài)的高度保守的信號系統(tǒng)。近來研究顯示異常wnt/β-catenin信號通路與肝臟纖維組織增生的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，表明它可能是中醫(yī)藥物作用于肝臟纖維化新的治療靶點(diǎn)。肝復(fù)康是我校病理生理教研室經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)出的中藥防治肝纖維化經(jīng)驗(yàn)方。它具有改善肝臟功能、延緩脂肪變性等效用。丹參是一種具有改善肝臟組織微循環(huán)，促進(jìn)細(xì)胞代謝的單味中藥。
　　CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型

2、飼養(yǎng)一段時間后，取大鼠肝臟組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。模型組、肝復(fù)康治療組和丹參治療組的比較是為了觀察肝復(fù)康和丹參是否能改善肝纖維化病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志α平滑肌肌動蛋白的含量，抑制促纖維化通路wnt/β-catenin靶基因的表達(dá)。正常對照組、肝復(fù)康對照組和丹參對照組的比較是研究肝復(fù)康和丹參能否對正常肝臟wnt經(jīng)典通路產(chǎn)生活化影響而有促肝纖維化毒性。本次試驗(yàn)通過以上六個組別的設(shè)立來探討肝復(fù)康和丹參對肝纖維化wnt/β-catenin

3、的作用機(jī)制并對丹參和肝復(fù)康干預(yù)肝纖維化wnt/β-catenin通路的效果進(jìn)行比較。
　　方法:
　　大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供60只健康SD大鼠，清潔級，體重200-250克（雌雄不限）。正常喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為丹參治療組(D)、肝復(fù)康對照組(GC)、丹參對照組(DC)、正常對照組(C)、模型組(M)和肝復(fù)康治療組(MG)各10只。除對照組外，其余大鼠每周兩次皮下注射橄欖油稀釋的10％的CC4溶液(5ml/kg)，共8周

4、。肝復(fù)康對照組、丹參對照組和正常對照組以同樣方法皮下注射生理鹽水共8周。藥物對照組、丹參治療組和肝復(fù)康治療組于造模第四周起開始分別用丹參2.5ml/kg/天和肝復(fù)康4.16ml/kg/天灌胃大鼠，持續(xù)到第8周。肝復(fù)康和丹參藥物濃度分別為315 mg/kg和250mg/kg。以上各劑量藥物均溶于10ml/kg的生理鹽水中。于8周末處死各組大鼠，即刻切取肝組織。一部分用10％的甲醛固定并制成石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。另一部分

5、于-80℃冰箱保存用于分子生物學(xué)檢測。
　　免疫組織化學(xué)法觀察和定位α平滑肌肌動蛋白的分布、表達(dá)及含量，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Tcf-4、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、wnt1、wnt3a的表達(dá)水平。β-連環(huán)蛋白用免疫蛋白印跡(Westernblot)方法檢測。SPSS17.0軟件包應(yīng)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有意義，P＜0.01為差異有顯著性意

6、義。
　　結(jié)果:
　　觀察各組大鼠精神狀態(tài)，進(jìn)食及運(yùn)動情況。處死后觀察各組大鼠大體肝臟情況。
　　HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠肝細(xì)胞水腫和脂肪變性，假小葉形成。丹參對照組、肝復(fù)康對照組和正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整。肝復(fù)康治療組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，細(xì)胞脂肪變性減少。丹參治療組效果不明顯。
　　免疫組化半定量顯示肝復(fù)康治療組大鼠肝組織α-SMA的累計(jì)光密度值明顯低于模型組并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，丹參治療組大

7、鼠肝組織α-SMA的累計(jì)光密度值與模型組無顯著性差異，丹參對照組、肝復(fù)康對照組和正常對照組三者α-SMA的累計(jì)光密度值無顯著性差異。模型組α-SMA較丹參對照組、正常對照組、肝復(fù)康對照組顯著增加(P＜0.01)。
　　CCL4處理過的模型組進(jìn)行RT-PCR結(jié)果顯示，wnt1、wnt3a、CyclinD1、Tcf-4、β-catenin的mRNA較丹參對照組、正常對照組、肝復(fù)康對照組顯著增加(P＜0.01)，肝復(fù)康對照組、丹參對照組

8、和正常對照組三者比較無顯著性差異，肝復(fù)康治療組mRNA比模型組明顯下降(P＜0.05)，丹參治療組與模型組比較無顯著性差異。
　　Western blot結(jié)果顯示β-catenin在肝復(fù)康對照組、丹參對照組和正常對照組表達(dá)最少，對照組表達(dá)明顯低于丹參治療組與模型組(P＜0.01)，肝復(fù)康治療組與模型組相比表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.肝復(fù)康和丹參對正常大鼠肝臟組織wnt經(jīng)典通路無影響。