XAV939對肝星狀細胞中Wnt-β-catenin與Wnt-JNK通路的影響及肝復(fù)康的干預(yù)機制.pdf

1、目的:
　　 作為肝纖維化發(fā)生過程中的核心環(huán)節(jié)，活化的肝星狀細胞自身細胞外基質(zhì)的分泌，引發(fā)肝纖維化。Wnt信號通路分為經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路，在人和動物的生長過程中控制著無數(shù)的生物學(xué)現(xiàn)象。關(guān)于Wnt/β-catenin與Wnt/JNK信號通路參與肝星狀細胞的活化的研究較多，但是研究結(jié)果存在著較大的分歧，對于Wnt/β-catenin與Wnt/JNK信號通路在肝星狀細胞活化過程中所起的作用尚不能明確。中藥肝復(fù)康經(jīng)

2、本實驗室多次試驗證實對Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信號通路具有較好的抑制作用，而XAV939為Wnt/β-catenin信號通路的特異性阻滯劑。本實驗通過使用肝復(fù)康和XAV939作用于肝星狀細胞HSC-T6株，來觀察抑制Wnt/β-catenin和Wnt/JNK信號通路在肝星狀細胞活化中所起的作用。希望本研究探討肝星狀細胞活化的分子機制并對肝纖維化的治療有所幫助。
　　 方法:
　　 大鼠HSC-T6細胞株

3、用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37℃，5％CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)，傳代。待細胞條件合適時，細胞用不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24h。
　　 細胞于96細胞培養(yǎng)板孔板隨機分為:正常血清組（含10％正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9391umol/L組（含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9392umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基);

4、XAV9394umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9394umol/L的DMEM培養(yǎng)基);XAV9398umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9398umol/L的DMEM培養(yǎng)基）肝復(fù)康治療組（含10％肝復(fù)康治療組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）。于37℃，5％CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)48h。采用MTT法觀察肝星狀細胞在不同濃度XAV939及肝復(fù)康藥物血清的作用下細胞的生長增殖情況。
　　 細胞于六孔板中隨機分為:正常血清

5、組（含10％正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9391umol/L組（含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基）;XAV9392umol/L(含10％正常大鼠血清，XAV9391umol/L的DMEM培養(yǎng)基);肝復(fù)康治療組（含10％肝復(fù)康治療組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）。于37℃，5％CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)48h。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptasepolymerasechain

6、reaction，RT-PCR)法測定細胞中collagenⅠ，a-SMA，β-catenin，Wnt1，F(xiàn)rizzled1，F(xiàn)rizzled2，MKK4，MKK7，JNK等基因mRNA的表達，免疫蛋白印跡法(westernblot)觀測細胞中β-catenin和p-JNK蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法結(jié)果:與正常血清組相比，XAV9391umol/L，2umol/L，4umol/L，8umol/L組，以

7、及肝復(fù)康血清組均對肝星狀細胞的增值活化起到抑制作用，使用紫外分光光度計測量其OD值，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，其他五組的抑制作用較明顯(P＜0.05)。但是XAV9394umol/L，8umol/L組與XAV9392umol/L組差別無顯著性。
　　 2.RT-PCR法結(jié)果:與正常血清組相比，肝復(fù)康血清組collagenⅠ，a-SMA,β-catenin,Wnt1,Frizzled1,Frizzled2,MKK4,MKK7,JNK1在基

8、因水平表達均有明顯的下降(P＜0.05)，XAV9391umol/L，2umol/L組collagen，a-SMA，β-catenin，Wnt1，F(xiàn)rizzled1在基因水平均有明顯下降(P＜0.05)，其下降程度與肝復(fù)康藥物血清組無顯著性差別。XAV9391umol/L，2umol/L組Frizzled2，MKK4，MKK7，JNK1的表達與正常血清組比較無明顯差別，但與肝復(fù)康藥物血清組比較差別顯著。
　　 3.Western

9、-blot法結(jié)果:與正常血清組相比肝復(fù)康血清組β-catenin和p-JNK表達顯著下降(P＜0.05)，XAV9391umol/L，2umol/L組β-catenin表達也顯著下降(P＜0.05)，與肝復(fù)康組相比無顯著性差別，而p-JNK表達則不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.在HSC-T6細胞活化過程中，Wnt/β-catenin信號通路相對于Wnt/JNK信號通路起主要作用。
　　 2.肝復(fù)康對Wnt/β-