CTGF-整合素-FAK信號(hào)通路在肝纖維化中的表達(dá)變化以及肝復(fù)康的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 肝纖維化是慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的漸進(jìn)性病理過程，是肝臟在多種損傷因素作用下發(fā)生的慢性代償性修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，涉及到細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，并且有多種細(xì)胞因子參與。因此，肝纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。
　　 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一種多功能的分泌性多肽，可以調(diào)節(jié)細(xì)

2、胞增殖、分化以及黏附等生物學(xué)活性，在組織損傷修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)合成等方面發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，CTGF在肝纖維化中發(fā)揮促進(jìn)纖維化發(fā)生發(fā)展的正調(diào)節(jié)作用。整合素是存在于肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)等細(xì)胞表面的受體蛋白，近年研究發(fā)現(xiàn)CTGF可以通過與整合素受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的活性。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是整合素信號(hào)通路中重要的細(xì)胞因子，激活后可以進(jìn)一步啟

3、動(dòng)下游一系列細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前，CTGF促進(jìn)肝纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制還未完全明了，CTGF/整合素/FAK信號(hào)通路與肝纖維化的關(guān)系也尚無明確報(bào)道。
　　 傳統(tǒng)中藥在慢性肝臟疾病治療中取得了一定的療效，復(fù)方中藥肝復(fù)康在治療肝纖維化等慢性肝臟疾病中能夠發(fā)揮有效成分豐富、生物學(xué)靶點(diǎn)多樣等優(yōu)點(diǎn)。本課題組已有研究發(fā)現(xiàn)肝復(fù)康能夠明顯改善肝功能、抑制炎癥反應(yīng)和延緩纖維化的進(jìn)展過程。然而肝纖維化的發(fā)生機(jī)制中有多種細(xì)胞因子以及多條細(xì)胞信號(hào)通路

4、參與，因此，肝復(fù)康的治療肝纖維化的分子機(jī)制仍需完善。
　　 本研究的目的在于:
　　 第一，觀察CTGF/整合素/FAK信號(hào)通路中CTGF、整合素α5β1、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、FAK、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、核糖體S6蛋白激酶（ribosomal protein S

5、6 kinase，P70S6K）等關(guān)鍵蛋白分子在肝纖維化中的表達(dá)變化，探討CTGF/整合素/FAK通路在肝纖維化中的作用;
　　 第二，觀察肝復(fù)康對(duì)CTGF/整合素/FAK信號(hào)通路在肝纖維化中表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究肝復(fù)康治療肝纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法:
　　 采用皮下注射CCl4法復(fù)制肝纖維化動(dòng)物模型:將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型組、肝復(fù)康大、中、小劑量治療組，每組10只。除正

6、常對(duì)照組外，其余各組大鼠皮下注射以橄欖油稀釋的10％CCl4(5ml/kg)，每周2次，正常對(duì)照組只注射同等體積的橄欖油;在肝復(fù)康大、中、小劑量治療組，從注射CCl4后第9周開始，分別每天給予肝復(fù)康(3125 mg/kg、312.5 mg/kg和31.25mg/kg)灌胃，至第20周結(jié)束。
　　 乙醛刺激法激活體外培養(yǎng)的HSCs:將傳代培養(yǎng)的HSCs隨機(jī)分為三組，分別為正常對(duì)照組:在含10％正常對(duì)照組血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基上常

7、規(guī)培養(yǎng);模型組（乙醛刺激）:在含10％正常對(duì)照組血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L）;肝復(fù)康治療組（乙醛刺激+肝復(fù)康含藥血清）:在含10％的肝復(fù)康藥物血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中加入乙醛（終濃度200μmol/L）。
　　 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、免疫組織化學(xué)(IHC)以及免疫蛋白印跡(Western-blot)方法，檢測(cè)各組大鼠肝組織中以及各組HSCs中CTGF/整合素α5β1/FAK

8、信號(hào)通路中關(guān)鍵細(xì)胞因子的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.CTGF、纖連蛋白和整合素α5β1在肝纖維化中的表達(dá)及肝復(fù)康的干預(yù)作用
　　 RT-PCR、Western-blot和免疫組化法觀察大鼠肝組織中CTGF、整合素α5、整合素β1以及纖連蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，肝纖維化模型組中各指標(biāo)的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平均有明顯提高(P＜0.01);而在肝復(fù)康治療組中，CTGF、整合素α5、整合

9、素β1以及纖連蛋白的表達(dá)量比模型組明顯下降(P＜0.01)。
　　 體外培養(yǎng)的HSCs中，乙醛刺激激活的HSCs模型組中，CTGF、整合素α5、整合素β1以及纖連蛋白的mRNA表達(dá)水平比正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01);而經(jīng)過肝復(fù)康含藥血清作用后，與模型組相比，各指標(biāo)的基因表達(dá)量明顯下降(P＜0.01)。
　　 2.FAK/Akt信號(hào)通路在肝纖維化中的作用以及肝復(fù)康的調(diào)節(jié)
　　 與正常對(duì)照組相比，肝纖維化模型組

10、大鼠肝組織P-FAK和P-Akt的表達(dá)顯著增多(P＜0.01);肝復(fù)康治療組中二者的磷酸化程度與模型組相比，有明顯下降(P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示，模型組的大鼠肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA) mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯增高（P＜0.01）;肝復(fù)康治療后大鼠肝組織α-SMA mRNA表達(dá)量較模型組明顯減少（P＜0.01）。
　　 正常對(duì)照組HSCs表達(dá)少量的FA

11、K，Akt以及α-SMA mRNA;模型組HSCs上述基因表達(dá)水平比正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）;肝復(fù)康含藥血清治療組HSCs表達(dá)FAK，Akt以及α-SMA mRNA水平比模型組明顯下降(P＜0.01)。
　　 3.mTOR/P70S6K信號(hào)通路與肝纖維化的關(guān)系以及肝復(fù)康的抑制作用
　　 mTOR、P70S6K、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA在正常對(duì)照組中表達(dá)量很少;而在模型組中，以上指標(biāo)的表達(dá)水平明顯上調(diào)，比正常對(duì)

12、照組明顯增多（P＜0.01）;在肝復(fù)康治療組中，肝復(fù)康明顯下調(diào)了各指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平，與模型組相比，明顯降低(P＜0.01)。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織cyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有明顯升高（P＜0.01）;而肝復(fù)康治療后，二者合成量較模型組明顯減少(P＜0.01)。
　　 正常對(duì)照組HSCs中，mTOR、 P70S6K、cyclinD1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量極少;而乙醛刺激的HSCs模型

13、組中，以上細(xì)胞因子的基因表達(dá)量比正常對(duì)照組明顯增多(P＜0.01);肝復(fù)康含藥血清作用后的HSCs與模型組相比，上述指標(biāo)的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1.CTGF/整合素α5β1/FAK信號(hào)通路的激活促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　 2.體外培養(yǎng)HSCs的激活、增殖與CTGF/整合素α5β1/FAK信號(hào)通路的活化有關(guān)。
　　 3.肝復(fù)康通過抑制CTGF/整合素α5β1