中藥肝復(fù)康對肝纖維化時RHO通路干預(yù)的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 肝纖維化是肝臟受損后機體可逆的傷口愈合反應(yīng)階段，以ECM(extracellularmatrix)沉積為特點。如果不及時治療，將會導(dǎo)致肝硬化的形成。所以抗肝纖維化治療具有非常重要意義，但是目前對肝纖維化的機制尚不明確。RHO信號通路主要是調(diào)節(jié)細胞收縮，遷移，增殖，形態(tài)以及基因的表達。這個信號通路與很多疾病密切相關(guān)，如血管痙攣，腎纖維化，神經(jīng)損傷，肺動脈高壓等。所以RHO信號通路具有潛在的臨床治療價值。本實驗的目的是

2、為了研究肝復(fù)康對肝纖維化時RHO信號通路干預(yù)的實驗研究。
　　 方法:
　　 整體實驗:健康的SD大鼠隨機被分為正常組，肝纖維化模型組及三組藥物治療組。正常組予皮下注射生理鹽水（0.5ml/kg），其余各組予等體積橄欖油稀釋的10％CCl4皮下注射，每周兩次，共12周。三組康復(fù)康中藥處理組分別為:高劑量組(3125mg/kg/day)，，中劑量組(312.5mg/kg/day)及低劑量組(31.25mg/kg/day)。

3、在第九周開始給大鼠予肝復(fù)康高、中、低劑量治療。正常組與模型組在12周末處死并迅速取出肝組織，中藥治療組于第20周處死并取出肝組織，立即儲存于-70℃冰箱中。HE染色法觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)的變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測組織中RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin的mRNA水平的表達，免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印記法(wersternblot)檢測組織中ROCKI蛋白水平的表達。
　　 離體實驗:HSC-T6細胞

4、培養(yǎng)在加入了10％胎牛血清，100U/ml青霉素G及100U/ml鏈霉素的DEMN培養(yǎng)基中，并置于孵育箱中培養(yǎng)(37℃，5％CO2及95％O2)。每兩天換液一次。細胞傳代后，實驗在呈指數(shù)生長的細胞中進行。實驗隨機分為三組:正常對照組（DEMN培養(yǎng)液+10％正常大鼠血清+HSC細胞），模型組（DEMN培養(yǎng)液+終濃度200umol/L乙醛+10％正常大鼠血清+HSC細胞），肝復(fù)康治療組（DEMN培養(yǎng)液+終濃度200umol/L乙醛+10％肝

5、復(fù)康中劑量組大鼠血清+HSC細胞）。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法檢測細胞中RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin的mRNA水平的表達，免疫蛋白印記法(wersternblot)檢測細胞中ROCKI在蛋白水平的表達。
　　 結(jié)果:
　　 (1)肝復(fù)康對大鼠肝組織中RHO信號通路相關(guān)因子表達的影響:HE染色觀察到正常肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索呈放射狀排列，肝細胞形態(tài)正常，無脂肪空泡。模型組可見假小葉生成，正

6、常肝小葉被破壞，多數(shù)肝細胞出現(xiàn)脂肪變，大量炎癥細胞浸潤。中藥治療組肝組織纖維化表現(xiàn)不同程度的改善，以中劑量組最為明顯。RT-PCR結(jié)果顯示，在肝組織中RHO通路相關(guān)因子RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin在模型組均有明顯表達，而在正常組表達極少，肝復(fù)康治療組均使以上因子不同程度的下調(diào)，而中劑量治療效果最為明顯。免疫組織化學(xué)和westernblot結(jié)果顯示，在正常組ROCKI蛋白表達很微弱，而在模型組ROCKI的表達明顯上調(diào)，中

7、藥治療組均不同程度的使ROCKI表達下調(diào)，以中劑量治療組最為明顯，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)肝復(fù)康對大鼠HSC-T6細胞株中RHO信號通路相關(guān)因子表達影響:RT-PCR結(jié)果顯示，RHO通路相關(guān)因子RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin在乙醛組均有明顯表達，而在正常組表達極少，肝復(fù)康中劑量治療組均使以上因子不同程度的下調(diào)，westernblot結(jié)果顯示，在正常組ROCKI蛋白表達很微弱，而在乙醛組R