精準(zhǔn)靶向代謝組學(xué)方法的優(yōu)化建立與多生物基質(zhì)應(yīng)用研究.pdf

1、代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)后出現(xiàn)的新興學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。它通過(guò)定性鑒別和定量描述生物基質(zhì)中小分子代謝物的表達(dá)與修飾變化來(lái)系統(tǒng)反饋生命體對(duì)自身機(jī)體調(diào)控或者外界環(huán)境擾動(dòng)所做出的代謝應(yīng)答。當(dāng)前，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于藥理毒理，疾病發(fā)病機(jī)制和臨床診斷，植物生長(zhǎng)發(fā)育等研究領(lǐng)域并取得良好的進(jìn)展。以往的代謝組學(xué)研究以非靶向研究方法為主，即采用核磁共振和質(zhì)譜平臺(tái)進(jìn)行不同生物基質(zhì)中小分子代謝產(chǎn)物(代謝組)的無(wú)歧視全掃描分析，以

2、獲得最大化的代謝組信息。然而，由于分析儀器固有屬性的特殊性，非靶向代謝組學(xué)方法一方面無(wú)法高靈敏檢測(cè)具有特殊屬性的代謝物，同時(shí)，目前一個(gè)最大瓶頸就是差異代謝物的精準(zhǔn)鑒定與定量。面臨如此困境，靶向代謝組學(xué)方法在突破通量的瓶頸的前提下，將是一個(gè)優(yōu)勢(shì)選擇，尤其解決多生物基質(zhì)的目標(biāo)代謝組的精準(zhǔn)定性和定量問(wèn)題，即不需要繁瑣的代謝產(chǎn)物的鑒定過(guò)程，另對(duì)每個(gè)目標(biāo)代謝產(chǎn)物精準(zhǔn)優(yōu)化分析參數(shù)，達(dá)到最佳靈敏檢出?；诖?，本研究擬基于高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC

3、/TQ MS系統(tǒng))和目標(biāo)小分子代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化開(kāi)發(fā)能夠高靈敏分析目標(biāo)代謝組的精準(zhǔn)靶向代謝組學(xué)方法，并將該方法應(yīng)用于不同生物基質(zhì)的目標(biāo)代謝組分析，驗(yàn)證普適性，以實(shí)現(xiàn)方法寬口徑應(yīng)用于多基質(zhì)精準(zhǔn)修飾代謝組分析和應(yīng)用研究。
　　本研究首先通過(guò)對(duì)目標(biāo)代謝組的標(biāo)準(zhǔn)化合物以針泵進(jìn)樣模式進(jìn)行三重四級(jí)桿分析 MRM定性和定量參數(shù)的手動(dòng)優(yōu)化，并結(jié)合多分析參數(shù)自動(dòng)優(yōu)化，穩(wěn)定建立糖、氨基酸、核酸、維生素、有機(jī)酸和生物堿共6大類203個(gè)目標(biāo)代謝物的MRM

4、定性檢測(cè)和定量分析方法。并在此基礎(chǔ)上，針對(duì)性地優(yōu)化高效液相色譜分離分析參數(shù)，通過(guò)對(duì)不同化學(xué)類型色譜柱、流動(dòng)相梯度、流動(dòng)相的 pH值和柱溫等色譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的色譜條件，最終成功建立能同時(shí)快速穩(wěn)定分析152個(gè)目標(biāo)代謝物的的LC/TQ MS精準(zhǔn)靶向代謝組分析方法。
　　針對(duì)已經(jīng)建立的精準(zhǔn)靶向代謝組分析方法，本研究進(jìn)行隨機(jī)的方法學(xué)驗(yàn)證，分別考察該方法學(xué)的檢測(cè)限、定量限、線性、穩(wěn)定性和重復(fù)性等方面內(nèi)容，即選取果糖、胞嘧啶、亮氨酸、

5、煙酸、硫胺素和乙酰膽堿為代表性代謝物。結(jié)果表明，它們的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999，日間精密度和日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5％。確證所優(yōu)化建立的方法靈敏度高，線性、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可應(yīng)用于精準(zhǔn)靶向代謝組學(xué)研究。
　　為了驗(yàn)證所開(kāi)發(fā)代謝組分析方法的生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用研究的普適性，我們將已建立的基于 LC/MS的精準(zhǔn)靶向代謝組分析方法應(yīng)用于不同生物基質(zhì)的的代謝組分析。本研究主要選擇生物體液(尿液和血液)、

6、微生物、細(xì)胞、植物組織和昆蟲(chóng)等進(jìn)行代謝組分析，并通過(guò)應(yīng)用多種模式識(shí)別方法(Heatmap和 PCA等)對(duì)處理組和正常對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)組分析。最終結(jié)果顯示，每種生物基質(zhì)靶向代謝組的處理組和正常對(duì)照組均可顯著區(qū)分，而且組內(nèi)不同生物樣品明顯聚集分布。因此，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，前述所開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)靶向代謝組方法具有良好穩(wěn)定性和區(qū)分度，可滿足不同生物基質(zhì)的代謝組研究的需要，用于不同生物學(xué)科學(xué)問(wèn)題的解決。
　　綜上所述，本研究已經(jīng)成功建立了基于高效液相色譜質(zhì)

7、譜聯(lián)用系統(tǒng)的精準(zhǔn)靶向代謝組分析方法，該方法穩(wěn)定靈敏覆蓋150個(gè)具有明確生理功能的小分子代謝物，這些代謝物涉及100個(gè)以上主要代謝通路，它們生物合成和表達(dá)水平的修飾改變反饋許多至關(guān)重要的生物學(xué)過(guò)程和生物學(xué)事件。并且，該代謝組分析方法具有良好的普適性，已成功地應(yīng)用于體液(尿液和血清)、微生物、細(xì)胞、植物組織和昆蟲(chóng)等不同生物基質(zhì)的精準(zhǔn)靶向代謝組學(xué)研究?？傊?，本研究首次開(kāi)發(fā)了一套精準(zhǔn)靶向代謝組分析方法，可普適性應(yīng)用于不同生物基質(zhì)的精準(zhǔn)靶向代謝組