膠霉毒素誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞凋亡及對(duì)相關(guān)凋亡基因、凋亡蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過煙曲霉感染人支氣管上皮細(xì)胞體外模型，觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清液膠霉毒素水平和人支氣管上皮細(xì)胞的相關(guān)凋亡基因、凋亡蛋白及凋亡率的改變來探討膠霉毒素在人支氣管上皮細(xì)胞煙曲霉感染中的作用及其機(jī)制。
　　方法：（1）菌株的培養(yǎng)：將煙曲霉菌接種到PDA瓊脂平板，置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3-4天，連續(xù)活化兩次，PBS重懸孢子并計(jì)數(shù)。（2）野生型人支氣管上皮細(xì)胞（HBE）的培養(yǎng)：將支氣管上皮細(xì)胞以密度為106/ml接種于直徑10cm培養(yǎng)皿中，每

2、皿加入5ml細(xì)胞懸液，再加入新鮮含10％FBS培養(yǎng)液后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。（3）共培養(yǎng)模型的建立：當(dāng)細(xì)胞密度為80%以上時(shí)，按1:1000（菌孢子數(shù):支氣管上皮細(xì)胞數(shù)）加入菌懸液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3h，PBS沖洗，棄上清液，加入一定量的RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。（4）結(jié)果的測(cè)定：分別于共培養(yǎng)12h、24 h、36 h終止實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和支氣管上皮細(xì)胞，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

3、（LC-MS）、RealTime-PCR、Wester-Blot和流式細(xì)胞儀（Annexin V-FITC法）技術(shù)，檢測(cè)各共培養(yǎng)模型中上清液膠霉毒素的水平及支氣管上皮細(xì)胞相關(guān)凋亡基因、凋亡蛋白的變化及凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）測(cè)定膠霉毒素水平結(jié)果顯示：與對(duì)照組（共培養(yǎng)模型0h時(shí)間點(diǎn)，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)組上清液膠霉毒素水平隨時(shí)間逐漸升高

4、（P<0.05）；AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液組未檢測(cè)到膠霉毒素。AF293單獨(dú)培養(yǎng)組及AF293支氣管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)組上清液膠霉毒素水平隨時(shí)間逐漸升高（P<0.05），在36h時(shí)間點(diǎn)AF293支氣管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)組膠霉毒素水平高于AF293單獨(dú)培養(yǎng)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2. RT-PCR檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞相關(guān)凋亡基因結(jié)果顯示：與對(duì)照組（共培養(yǎng)模型0h時(shí)間點(diǎn)，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，各共培養(yǎng)組細(xì)

5、胞bc l-2凋亡基因表達(dá)水平呈逐漸降低（P<0.05），Bak凋亡基因表達(dá)水平呈逐漸升高（P<0.05）；將 AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)組分別與AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)比較，在36h時(shí)間點(diǎn)凋亡基因bcl-2、bak表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.005）。
　　3. Wester-Blot檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞凋亡蛋白結(jié)果顯示：與對(duì)照組（共培養(yǎng)模型0h時(shí)間點(diǎn)，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，各共培養(yǎng)組細(xì)胞bc

6、l-2凋亡蛋白合成水平呈逐漸降低（P<0.05），Bak凋亡蛋白合成水平呈逐漸升高（P<0.05）；將 AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)組分別與AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)比較，在36h時(shí)間點(diǎn)凋亡蛋白bcl-2、bak合成水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.005）。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示：與對(duì)照組（共培養(yǎng)模型0h時(shí)間點(diǎn)，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，各共培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率呈逐漸升高（P<0.05

7、）；將AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)組分別與AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)比較，在36h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.005）。
　　結(jié)論：
　　1.膠霉毒素在支氣管上皮細(xì)胞煙曲霉感染過程中發(fā)揮著重要作用。
　　2.膠霉毒素可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞凋亡，且 Bak、Bcl-2可能是膠霉毒素在支氣管上皮細(xì)胞煙曲霉感染過程中發(fā)揮作用的重要位點(diǎn)。
　　3.支氣管上皮細(xì)胞煙曲霉感染過程中煙曲霉可