高靈敏熒光各向異性核酸探針的構(gòu)建及其應(yīng)用研究.pdf

1、近年來，由于核酸分子探針具有設(shè)計多樣性、靈敏度高和強的定量分析能力等特點，發(fā)展靈敏度高和選擇性好的核酸分子探針成為生物化學(xué)分析領(lǐng)域研究的熱點之一。熒光各向異性，也被稱作熒光偏振，是熒光物質(zhì)的特有屬性，因其快速、精確、靈敏的信號報告，使得熒光各向異性檢測方法廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建。熒光各向異性檢測分析法作為一種比值檢測方法，其值與熒光基團的振動弛豫時間密切相關(guān)，而振動弛豫時間與熒光基團所結(jié)合分子的分子量或分子體積呈正相關(guān)。熒光各向異性

2、具有抗光漂白以及減小雜散光干擾等能力，其能夠直接用于復(fù)雜生物體系的分析檢測。隨著科研的不斷發(fā)展，熒光各向異性分析檢測方法已被廣泛應(yīng)用于蛋白檢測、藥物篩選、食品分析、環(huán)境監(jiān)測及生物化學(xué)研究等領(lǐng)域。然而依靠熒光分子質(zhì)量或體積變化從而實現(xiàn)目標檢測的傳統(tǒng)熒光各向異性分析法在生物小分子檢測分析方面存在一定困難。因為小分子自身分子量較小，與熒光分子結(jié)合之后質(zhì)量變化小，此時熒光各向異性值變化就很微弱，該報告信號很難被檢測到。為了解決該問題，科研工作者

3、引入核酸適配體的應(yīng)用，發(fā)展了一系列基于競爭取代機理、誘導(dǎo)構(gòu)象變化機理以及質(zhì)量放大策略的核酸熒光各向異性探針用于生物小分子檢測分析。在本論文中，我們設(shè)計了一系列新穎的質(zhì)量放大熒光各向異性信號的核酸探針，并成功應(yīng)用于三磷酸腺苷（ATP）、腺苷、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)等生物小分子檢測。具體內(nèi)容如下：
　　（1）利用雜交鏈反應(yīng)以及鏈霉親和素的雙重熒光各向異性信號放大策略，我們提出了一種靈敏高、選擇性好的熒光各向異性核酸探針，

4、并將其應(yīng)用于小分子ATP的檢測分析，其檢測下限為100 nM。與單獨以蛋白質(zhì)作為信號放大器或單獨以雜交鏈反應(yīng)作為放大策略進行對比，該實驗的雙重信號放大策略具有更高的靈敏度。此外，該設(shè)計探針能夠用于多種復(fù)雜的生物樣品中目標小分子ATP的定量檢測，如在細胞培養(yǎng)基、人的血清以及人的尿液中，可以檢測到0.5μM的ATP，初步證實該探針在實際生物樣品中的潛在應(yīng)用。（第2章）
　　（2）結(jié)合鏈霉親和素-生物素復(fù)合物和目標誘導(dǎo)酶切保護機理，我們

5、發(fā)展了一種雙重放大熒光偏振信號的策略，用于高靈敏地檢測生物小分子熒光偏振核酸探針的構(gòu)建。與單獨以目標誘導(dǎo)酶切保護機理作為放大策略或單獨以蛋白質(zhì)作為信號放大器進行對比，該實驗的雙重信號放大策略具有更高的靈敏度。以腺苷為模型小分子，該策略檢測下限達500 nM，其檢測結(jié)果優(yōu)于先前報道的熒光偏振核酸探針。此外，該實驗方法具有普遍性，通過替換為不同的核酸適配體，可用于相應(yīng)目標小分子檢測。（第3章）
　?。?）利用T4 DNA連接酶對ATP

6、的高度依賴性和E.Coli DNA連接酶對NAD的高度依賴性，結(jié)合鏈霉親和素-生物素復(fù)合物作為熒光各向異性質(zhì)量放大器，我們發(fā)展了一種簡單、快速、高靈敏度、高選擇性的熒光各向異性核酸探針，并將其應(yīng)用于小分子ATP和NAD的檢測分析。當溶液中存在ATP或NAD時，DNA連接酶發(fā)生連接反應(yīng)，接上質(zhì)量放大部分，從而引起較大的質(zhì)量變化，產(chǎn)生檢測信號，其中ATP和NAD的檢測下限分別為50 nM和10 nM，均低于現(xiàn)有的熒光各向異性分析法文獻報道。