高靈敏熒光各向異性核酸探針的構建及其應用研究.pdf

1、近年來，由于核酸分子探針具有設計多樣性、靈敏度高和強的定量分析能力等特點，發(fā)展靈敏度高和選擇性好的核酸分子探針成為生物化學分析領域研究的熱點之一。熒光各向異性，也被稱作熒光偏振，是熒光物質的特有屬性，因其快速、精確、靈敏的信號報告，使得熒光各向異性檢測方法廣泛應用于生物傳感器的構建。熒光各向異性檢測分析法作為一種比值檢測方法，其值與熒光基團的振動弛豫時間密切相關，而振動弛豫時間與熒光基團所結合分子的分子量或分子體積呈正相關。熒光各向異性

2、具有抗光漂白以及減小雜散光干擾等能力，其能夠直接用于復雜生物體系的分析檢測。隨著科研的不斷發(fā)展，熒光各向異性分析檢測方法已被廣泛應用于蛋白檢測、藥物篩選、食品分析、環(huán)境監(jiān)測及生物化學研究等領域。然而依靠熒光分子質量或體積變化從而實現(xiàn)目標檢測的傳統(tǒng)熒光各向異性分析法在生物小分子檢測分析方面存在一定困難。因為小分子自身分子量較小，與熒光分子結合之后質量變化小，此時熒光各向異性值變化就很微弱，該報告信號很難被檢測到。為了解決該問題，科研工作者

3、引入核酸適配體的應用，發(fā)展了一系列基于競爭取代機理、誘導構象變化機理以及質量放大策略的核酸熒光各向異性探針用于生物小分子檢測分析。在本論文中，我們設計了一系列新穎的質量放大熒光各向異性信號的核酸探針，并成功應用于三磷酸腺苷（ATP）、腺苷、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)等生物小分子檢測。具體內(nèi)容如下：
　?。?）利用雜交鏈反應以及鏈霉親和素的雙重熒光各向異性信號放大策略，我們提出了一種靈敏高、選擇性好的熒光各向異性核酸探針，

4、并將其應用于小分子ATP的檢測分析，其檢測下限為100 nM。與單獨以蛋白質作為信號放大器或單獨以雜交鏈反應作為放大策略進行對比，該實驗的雙重信號放大策略具有更高的靈敏度。此外，該設計探針能夠用于多種復雜的生物樣品中目標小分子ATP的定量檢測，如在細胞培養(yǎng)基、人的血清以及人的尿液中，可以檢測到0.5μM的ATP，初步證實該探針在實際生物樣品中的潛在應用。（第2章）
　　（2）結合鏈霉親和素-生物素復合物和目標誘導酶切保護機理，我們

5、發(fā)展了一種雙重放大熒光偏振信號的策略，用于高靈敏地檢測生物小分子熒光偏振核酸探針的構建。與單獨以目標誘導酶切保護機理作為放大策略或單獨以蛋白質作為信號放大器進行對比，該實驗的雙重信號放大策略具有更高的靈敏度。以腺苷為模型小分子，該策略檢測下限達500 nM，其檢測結果優(yōu)于先前報道的熒光偏振核酸探針。此外，該實驗方法具有普遍性，通過替換為不同的核酸適配體，可用于相應目標小分子檢測。（第3章）
　?。?）利用T4 DNA連接酶對ATP

6、的高度依賴性和E.Coli DNA連接酶對NAD的高度依賴性，結合鏈霉親和素-生物素復合物作為熒光各向異性質量放大器，我們發(fā)展了一種簡單、快速、高靈敏度、高選擇性的熒光各向異性核酸探針，并將其應用于小分子ATP和NAD的檢測分析。當溶液中存在ATP或NAD時，DNA連接酶發(fā)生連接反應，接上質量放大部分，從而引起較大的質量變化，產(chǎn)生檢測信號，其中ATP和NAD的檢測下限分別為50 nM和10 nM，均低于現(xiàn)有的熒光各向異性分析法文獻報道。