RNA干擾沉默大鼠椎間盤細胞Fas基因的實驗研究.pdf

1、椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease，DDD)是以椎間盤變性、椎體力學性能異常為始發(fā)因素的一個連續(xù)過程。由椎間盤退變而致的下腰痛(Low back pain，LBP)是現(xiàn)代社會中的一個常見問題。我國人口眾多，且社會老齡化逐年加劇，重視退變性椎間盤疾病的研究與治療具有重要意義。 引起椎間盤退變的原因是多方面、多層次的。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在椎間盤的衰老和退變中起重要作用，而Fas/Fas

2、L系統(tǒng)可能是椎間盤細胞主要的凋亡途徑。因此打斷Fas/FasL系統(tǒng)，減少椎間盤細胞的凋亡有望成為阻止椎間盤退變的手段。利用RNAi手段可以特異性地抑制相應(yīng)基因序列的表達，從而有望達到阻斷細胞的凋亡的目的。但有關(guān)的利用RNAi手段阻斷椎間盤細胞凋亡的研究未見報道。 本實驗設(shè)計并合成針對SD大鼠Fas基因的siRNA，轉(zhuǎn)染椎間盤細胞并與FasL(Fas Ligand)共培養(yǎng)，觀察經(jīng)Fas-siRNA轉(zhuǎn)染的椎間盤細胞Fas基因和蛋白表

3、達水平及細胞凋亡的變化，探討能否利用RNAi手段阻斷椎間盤細胞凋亡。 第一部分：SD大鼠腰椎間盤細胞的培養(yǎng)效率 目的：探討SD大鼠腰椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細胞的培養(yǎng)方法。 方法：用酶消化法分離培養(yǎng)SD大鼠腰椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細胞，經(jīng)倒置顯微鏡觀察、甲苯胺藍、番紅O染色和膠原Ⅱ免疫組化鑒定確定培養(yǎng)細胞類型。 結(jié)果：培養(yǎng)的椎間盤細胞經(jīng)鑒定為類軟骨細胞。 結(jié)論：用酶消化法

4、可成功培養(yǎng)大鼠腰椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細胞，細胞類型為類軟骨細胞。 第二部分：針對大鼠腰椎間盤細胞Fas基因的siRNA有效序列篩選 目的：探討化學合成的Fas-siRNA能否對體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤細胞Fas基因進行有效沉默。 方法：利用化學合成的siRNA轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)的椎間盤細胞。以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染，通過FAM熒光標記的siRNA(FAM-siRNA)轉(zhuǎn)染細胞檢測轉(zhuǎn)染率；另分六組：空白對照組不轉(zhuǎn)

5、染，無效序列siRNA轉(zhuǎn)染組為陰性對照組，針對GAPDH的siRNA轉(zhuǎn)染組為陽性對照組，三條Fas-siRNA轉(zhuǎn)染組分別為Fas-siRNA1組、Fas-siRNA2組、Fas-siRNA3組。轉(zhuǎn)染后在不同時間點分別觀察細胞形態(tài)，檢測細胞活性，檢測mRNA及蛋白表達情況。 結(jié)果：以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染大鼠腰椎間盤細胞，轉(zhuǎn)染率最高可達94.4％；化學合成的Fas-siRNA2能抑制體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤細胞Fas基因、蛋白的表達，48

6、小時達最低可分別達79.2％、71.3％。維持時間至少達72小時。 結(jié)論：化學合成的Fas-siRNA能對體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤細胞Fas基因進行有效沉默。以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染大鼠腰椎間盤細胞可獲很高的轉(zhuǎn)染率和抑制效果。 第三部分：不同劑量FasL對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染椎間盤細胞凋亡的影響 目的：探討重組大鼠FasL對在體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Fas-siRNA2大鼠腰椎間盤細胞的凋亡作用和Fa的基因和蛋白表達。 方

7、法：對單層培養(yǎng)的大鼠腰椎問盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細胞進行轉(zhuǎn)染和不轉(zhuǎn)染Fas-siRNA2，各設(shè)三組：三個轉(zhuǎn)染組和三個未轉(zhuǎn)染組各分別加入含不同濃度的FasL(0ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的1％FBS培養(yǎng)基共培養(yǎng)。24小時后，使用流式細胞術(shù)檢測各組凋亡率，RT-PCR評估Fas基因表達，Western Blot檢測蛋白表達。 結(jié)果：三個轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率均隨著FasL濃度的增加而增加；但相同濃度的