RNA干擾腫瘤細(xì)胞中Raf-1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默腫瘤細(xì)胞中Raf-1基因，通過一系列分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，分析腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，探討Raf-1蛋白激酶在不同腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡中的作用及機(jī)制。 方法：(1)構(gòu)建三種dsRNA載體pSIREN-shuttle-Raf-1 a,b和c，將構(gòu)建的載體經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞株HNEl，人喉癌細(xì)胞株Hep-2，人肺癌細(xì)胞株A549。(2)進(jìn)行TUNER染色觀察細(xì)胞凋亡，免疫組化染色觀察

2、Raf-1蛋白表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和Raf-1蛋白的表達(dá)水平。(3)采用MTT法對轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞生長曲線進(jìn)行描繪。(4)采用流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段細(xì)胞周期的改變。(5)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞凋亡情況。(6)選擇高感染效率載體，進(jìn)而構(gòu)建腺病毒載體Adeno-Raf-1b，包裝并擴(kuò)增(7)用Adeno-Raf-1b進(jìn)行體外RNA干擾實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：(1)pSIREN-shuttle-Raf-1-

3、b在3種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染中抑制Raf-1mRNA和Raf-1蛋白的表達(dá)效率較pSIREN-shuttle-Raf-1-a和pSIREN-shuttle-Raf-1-c增高。(2)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Raf-1蛋白在pSIREN-shuttle-Raf-1b轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)率下降，并且表達(dá)強(qiáng)度減弱。(3)細(xì)胞凋亡檢測pSIREN-shuttle-Raf-1-b表現(xiàn)出較強(qiáng)的促凋亡作用。抑制了3種腫瘤細(xì)胞的增殖(P<0.05)。(4)流式細(xì)

4、胞術(shù)檢測結(jié)果顯示， pSIREN-shtlttle-Raf-1-b可以阻止腫瘤細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，轉(zhuǎn)染后的增殖指數(shù)低于未轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。(5)流式細(xì)胞檢測凋亡結(jié)果顯示，pSIREN-shuttle-Raf-l-b可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)較明顯的凋亡。(6)腺病毒載體Adeno-Raf-l-b體外干擾A549腫瘤細(xì)胞較空病毒載體有促進(jìn)凋亡發(fā)生的效應(yīng)。(7)使A549細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯特有的細(xì)胞周期改變。 結(jié)論：Raf-l蛋白對腫瘤