RNA干擾技術(shù)沉默Gab1基因抑制血管生成的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)沉默Gab1基因使其在體外抑制血管生成的研究,為進(jìn)一步進(jìn)行抑制腫瘤血管生成和其他血管性疾病的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ),為腫瘤和其他血管性疾病的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)作為培養(yǎng)基,獲取3—7代EA.hy926細(xì)胞。
　　2、以G

2、ab1的mRNA已知序列為靶點(diǎn),構(gòu)建LV-Gab1-siRNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞,獲取Gab1基因特異的siRNA干擾EA.hy926細(xì)胞。
　　3、在24孔培養(yǎng)板上,將配好的基質(zhì)膠工作液以200~250ul/cm2的量加入孔中,建立體外血管生成的三維培養(yǎng)模型。取P4代EA.hy926細(xì)胞隨機(jī)分成3組(n=8):空白對(duì)照組為正常EA.hy926細(xì)胞接種組(n=8),EA.hy926細(xì)胞直接接種到含三維培養(yǎng)模型的孔

3、板中;陰性對(duì)照組為無(wú)關(guān)序列(LV-scr-siRNA)轉(zhuǎn)染組(n=8),操作與空白對(duì)照組相同,但是細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因Scr特異的siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染;干擾組為Gab1基因特異的siRNA干擾組(n=8),操作與空白對(duì)照組相似,但細(xì)胞經(jīng)過(guò)慢病毒介導(dǎo)Gab1基因特異的siRNA干擾。
　　4、將24孔培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中,24h后鏡下觀察血管樣結(jié)構(gòu)情況(數(shù)目、長(zhǎng)度)。
　　5、以上3組中的一部分EA.hy926細(xì)胞用于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶

4、連反應(yīng)(Real-timePCR)和westernblotting實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Gab1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平;采用Tanswell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組細(xì)胞的遷移能力;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1、EA.hy926細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染3d后,在熒光倒置顯微鏡下觀察到明顯的綠色熒光。
　　2、慢病毒干擾組細(xì)胞形態(tài)變化明顯,由長(zhǎng)梭形逐漸變成星形或多角形,而陰性和空白對(duì)照組細(xì)胞變化不明顯,呈梭形。
　　3、

5、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:慢病毒干擾組Gab1基因mRNA的表達(dá)水平明顯受抑制(P<0.05),而空白和陰性對(duì)照組之間均無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　4、Westernblot檢測(cè)證實(shí)慢病毒干擾組未見(jiàn)陽(yáng)性條帶,而陰性和空白對(duì)照組在110KDr均出現(xiàn)特異行條帶。
　　5、小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示:干擾組遷移細(xì)胞數(shù)量較空白組和陰性對(duì)照組明顯減少(P<0.05),而空白組和陰性對(duì)照組遷移的細(xì)胞數(shù)相近(P>0.05)。
　　6、流

6、式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡顯示:干擾組細(xì)胞凋亡比例較空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞均明顯高(P<0.05),而空白組和陰性對(duì)照組之間沒(méi)有明顯區(qū)別(P>0.05)。
　　7、LV-Gab1-siRNA轉(zhuǎn)染后的EA.hy926細(xì)胞在體外三維培養(yǎng)模型中血管樣結(jié)構(gòu)形成的數(shù)量和長(zhǎng)度均明顯減少(P<0.05),表明血管生成受到明顯抑制。
　　結(jié)論：
　　Gab1-siRNA能夠抑制EA.hy926細(xì)胞中Gab1基因的mRNA及其蛋白的表達(dá),