小片段干擾RNA沉默Molt-4細胞DNMT1基因?qū)M蛋白調(diào)控的實驗研究.pdf

1、目的:DNMT1小片段RNA干擾人急性T淋巴細胞性白血病Molt-4細胞的DNMT1(DNA methyltransferase 1)基因的表達,研究DNMT1基因干擾對Molt-4細胞增殖、細胞凋亡以及對組蛋白甲基化、乙酰化調(diào)控的影響,探討白血病基因治療的新靶點。
　　方法:(1)設(shè)計針對DNMT1基因的4個小干擾RNA片段,經(jīng)陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染Molt-4細胞后,應(yīng)用RT-PCR篩選出最

2、佳DNMT1干擾片段。
　　(2)應(yīng)用MTT法繪制細胞生長曲線,觀察DNMT1 siRNA對Molt-4細胞增殖的影響;應(yīng)用流式細胞術(shù)分析細胞的凋亡。
　　(3)應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測Bcl-2、procaspase-3、P15蛋白表達水平以及組蛋白H3K4、H3K9甲基化、組蛋白H3乙?；癄顟B(tài)的改變。
　　結(jié)果:(1)人DNMT1最佳的siRNA序列為Sense 5'-GCACCUCAUUUGCCGAAUATT-3'

3、Antisense 5'-UAUUCGGCAAAUGAGGUGCTT-3'。DNMT1siRNA轉(zhuǎn)染Molt-4細胞后可沉默該基因表達,并呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　(2)DNMT1 siRNA抑制Molt-4細胞增殖,且隨著濃度增加、作用時間延長,抑制率也逐漸上升。
　　(3)DNMT1 siRNA下調(diào)Molt-4細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、procaspase-3的表達,誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　(4)DNMT1 siRNA沉

4、默Molt-4細胞的DNMT1蛋白及DNMT1 mRNA表達,上調(diào)P15的表達;下調(diào)組蛋白H3K9甲基化水平,上調(diào)組蛋白H3K4的甲基化水平,而組蛋白H3乙酰化水平無明顯變化。
　　結(jié)論:(1)陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000介導(dǎo)DNMT1 siRNA導(dǎo)入Molt-4細胞,具有操作步驟簡單、轉(zhuǎn)染率高的特點。
　　(2)運用RNAi技術(shù),DNMT1 siRNA可以有效地抑制Molt-4細胞中DNMT1的表