夏枯草提取物體內(nèi)外抗B細(xì)胞淋巴瘤的作用及機(jī)制研究.pdf

1、淋巴瘤是最早發(fā)現(xiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一,起源于淋巴結(jié)和淋巴組織,其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種免疫細(xì)胞惡變有關(guān),是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。近幾年中國淋巴瘤的發(fā)病率呈上升趨勢,在惡性腫瘤死亡原因中已經(jīng)排在前十位。在中國,非霍奇金淋巴瘤(NHL)的發(fā)病率遠(yuǎn)大于霍奇金淋巴瘤(HL)的發(fā)病率,彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的淋巴瘤類型,其具有很強(qiáng)的異質(zhì)性,根據(jù)基因表達(dá)譜的不同,可分為GCBDLBCLs、ABC DLB

2、CLs和原發(fā)縱隔DLBCLs,他們產(chǎn)生于B細(xì)胞的不同分化階段。三種不同亞型的DLBCLs具有不同的預(yù)后,聯(lián)合化療是目前主要治療手段,在延長患者生存期和提高療效方面起著重要的作用?？笴D20隆抗體Rituximab聯(lián)合環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強(qiáng)的松(R-CHOP),在DLBCL中取得了一定的療效。盡管如此,仍約有三分之一的DLBCL患者沒有達(dá)到持久緩解,并發(fā)展為復(fù)發(fā)/難治性疾病,為提高DLBCL的效果,開發(fā)新的治療藥物勢在必行。

3、>　　夏枯草是一種軟堅(jiān)散結(jié)常用中藥,具有降糖、降壓、抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒及抗腫瘤等廣泛的藥理活性,因其較多的藥理活性,對(duì)夏枯草的研究也更深入而廣泛,尤其是其抗腫瘤作用。夏枯草可以用來治療甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤等各種腫瘤,夏枯草對(duì)惡性腫瘤的作用包括:(1)改善臨床癥狀和生活質(zhì)量,提高生存率;(2)對(duì)化、放療起減毒、增敏、增效的效應(yīng);(3)提高外科治療效果,減少手術(shù)并發(fā)癥和后遺癥;(4)預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、阻止癌前病變;(

4、5)抗氧化及免疫調(diào)節(jié)功能;(6)抑制腫瘤細(xì)胞生長,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。針對(duì)夏枯草的研究已經(jīng)很廣泛,但是作為發(fā)病率最高的淋巴瘤DLBCL,夏枯草對(duì)其作用的體內(nèi)外的研究尚無報(bào)道。
　　目的：
　　研究夏枯草提取物對(duì)DLBCL細(xì)胞株LY8的生物學(xué)功能,并探索其機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞株培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基,并放置于相對(duì)濕度95％,溫度為37℃、含有5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每2-3天根據(jù)細(xì)胞狀況更換或者添加

5、適量培養(yǎng)液。
　　2.細(xì)胞增殖:CCK8法檢測細(xì)胞增殖。不同濃度的夏枯草提取物、陽性對(duì)照藥長春新堿(vincristine,VCR)和溶劑對(duì)照作用于細(xì)胞48小時(shí),加入CCK8檢測液,利用酶標(biāo)儀來測定波長在450nm的吸光度。
　　3.細(xì)胞凋亡:夏枯草提取物及VCR作用于LY8細(xì)胞株48小時(shí)后,Annexin V/7AAD法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　4.Western Blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白及凋亡

6、相關(guān)蛋白:藥物作用于LY8細(xì)胞株48小時(shí)后提蛋白檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　5.建立小鼠LY8腫瘤模型,將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組,每組6只:夏枯草提取物高、中、低劑量組(經(jīng)腹腔分別注射夏枯草提取物400mg/kg/d、200mg/kg/d、100mg/kg/d,連續(xù)給藥8天);陽性對(duì)照組(經(jīng)腹腔注射長春新堿0.5mg/kg/d,第1天給藥);陰性對(duì)照組(經(jīng)腹腔注射等容量溶劑,連續(xù)注射8天)。觀察夏枯草提取物對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤率。

7、>　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示,運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行組間差異分析,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行繪圖。
　　結(jié)果：
　　1.夏枯草提取物對(duì)LY8、RAJI、DOHH2三種B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株的增殖均有抑制作用,與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著夏枯草提取物濃度的增加,細(xì)胞增殖抑制率越來越

8、大,抑制作用越強(qiáng),說明該藥在一定藥物濃度范圍內(nèi)具有量效依賴關(guān)系。該藥對(duì)三種細(xì)胞株的抑制率均可達(dá)到95％以上;對(duì)三種細(xì)胞株的平均IC50分別為:LY8,20.9μg/ml,RAJI,29.89μg/ml,DOHH2,38.89μg/ml,LY8細(xì)胞株的IC50值最小,LY8細(xì)胞對(duì)夏枯草提取物最敏感。
　　2.夏枯草提取物對(duì)LY8細(xì)胞株凋亡的影響,與溶劑對(duì)照組相比,夏枯草提取物組的LY8細(xì)胞凋亡率明顯增加。
　　3.對(duì)PI3K/

9、AKT/mTOR通路的影響:夏枯草提取物作用于LY8細(xì)胞48小時(shí)后,進(jìn)行Western-Blot分析,與不加藥物的空白對(duì)照組相比,夏枯草提取物組總的AKT蛋白表達(dá)無減少,而磷酸化的AKT蛋白表達(dá)減少,其下游蛋白磷酸化的m-TOR蛋白表達(dá)也減少,說明夏枯草提取物可抑制PI3K/AKT/mTOR通路。
　　4.對(duì)凋亡相關(guān)蛋白影響:對(duì)夏枯草提取物作用于LY8細(xì)胞48小時(shí)后,進(jìn)行Western-Blot分析,與不加藥物的空白對(duì)照組相比,夏

10、枯草提取物組凋亡蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)增多。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)溶劑對(duì)照組瘤體體積達(dá)到1556.03±181.81mm3;夏枯草提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組的瘤體體積分別為:626.79±85.43mm3,957.45±107.54mm3,1387.65±110.81mm3.腫瘤生長抑制率分別為:70.33％,45.23％,12.59％,與溶劑對(duì)照組相比,高劑量組和中劑量組與之差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義