夜香樹提取物Nocturnoside B體內(nèi)外抗肝癌作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討夜香樹提取物Nocturnoside B體外對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7404以及體內(nèi)對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7404荷瘤裸鼠的抗腫瘤作用及其機(jī)制。
　　方法:（1）用MTT檢測(cè)不同濃度的Nocturnoside B對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7404的增值的影響，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)學(xué)，平板集落形成試驗(yàn)檢測(cè)Nocturnoside B對(duì)細(xì)胞集落形成的影響，Hoechst染色，檢測(cè)Caspase3酶活性，用流式細(xì)胞儀（FCM）PI染色檢

2、測(cè)細(xì)胞周期變化，單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤BEL-7404細(xì)胞DNA的損傷，瑞氏染色。（2）選用人肝癌細(xì)胞BEL-7404建立荷瘤裸鼠，腫瘤長(zhǎng)到0.2～0.4 cm后將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，生理鹽水組、順鉑組和Nocturnoside B高﹑中﹑低組,劑量分別為6、4、2mg/kg。治療期間測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)徑和短徑；20d后眼眶取血并處死裸鼠，取瘤塊制成蠟塊，進(jìn)行常規(guī)病理切片；酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定裸鼠血清中 I L-8濃度，采用常規(guī)H

3、E染色、免疫組化DAB染色觀察瘤組織微血管密度的形成與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，增值細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67。
　　結(jié)果:（1）MTT結(jié)果顯示，Nocturnoside B對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7404的增殖具有顯著的抑制作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性關(guān)系。其48 h和72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為15.92μg/ml和8.86μg/ml。順鉑組的增殖亦存在抑制作用； Nocturnoside B處理后的 BEL-7404細(xì)

4、胞失去正常結(jié)構(gòu)，形態(tài)變圓，體積縮小，有部分細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂形成典型的凋亡小體。隨著藥物濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，培養(yǎng)基中可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片；平板細(xì)胞集落形成受到抑制；Hoechst染色后有的細(xì)胞核呈致密濃染，碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白發(fā)亮；檢測(cè)到Caspase3酶活性明顯增加；PI法檢測(cè)到G0/G1和G2/M期細(xì)胞數(shù)增，S期減少；單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)到“彗星”細(xì)胞出現(xiàn)的頻率升高，“彗星”尾長(zhǎng)度增加且形狀變

5、大。（2）Nocturnoside B高、中、低劑量組肝癌裸鼠腫瘤的相對(duì)增值率為38.86％、42.94％、48.26％。鏡下發(fā)現(xiàn)， Nocturnoside B高劑量組部分腫瘤細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核濃染，腫瘤組織壞死嚴(yán)重。與生理鹽水組相比較，Nocturnoside B高劑量組能明顯降低血清中白細(xì)胞介素-8的含量(P<0.01)；降低裸鼠腫瘤組織中微血管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的含量(P<0.05)；裸鼠腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原PCNA和

6、Ki-67的含量也明顯下降(P<0.05)。
　　結(jié)論:（1）Nocturnoside B在體外能夠顯著抑制人肝癌細(xì)胞BEL-7404，阻滯腫瘤細(xì)胞的G2/M期，劑量依賴性地引起B(yǎng)EL-7404細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，對(duì)DNA造成損傷，誘導(dǎo) BEL-7404細(xì)胞凋亡。（2）Nocturnoside B對(duì)人肝癌BEL-7404細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，可能通過(guò)降低血清中白細(xì)胞介素-8、微血管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、增殖