nrf2基因啟動(dòng)子多態(tài)性對(duì)酒精性肝病小鼠感染創(chuàng)傷弧菌的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察nrf2基因啟動(dòng)子-336位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)酒精性肝病小鼠感染創(chuàng)傷弧菌(VV)的影響及早期促/抗炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-10)、高遷移蛋白(HMGB1)的水平變化。
　　 方法：
　　 1．C57B6小鼠，300只，隨機(jī)取20只正常飼養(yǎng)，余下280只采用酒精梯度飼養(yǎng)法替代水飼養(yǎng)，56天后隨機(jī)取10只小鼠肝組織做病理，提示脂肪變性，完成酒精性肝病小鼠模型。正常小鼠中隨機(jī)取10只為正常對(duì)照組(A1組

2、=10只)，余10只腹腔注射VV（濃度為1×106cfu/ml，量為5ml/kg），制作創(chuàng)傷弧菌膿毒癥模型(C組)，染菌后48h死亡2只（C組=8只）；270只酒精肝病小鼠隨機(jī)取10只為酒精肝病模型組（B1組=10只），余下260只腹腔注射VV（腹腔注射濃度為1×106cfu/ml，量為5ml/kg），制作酒精肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥模型組（D組），染菌后48h，D組死亡59只（D組=201只），留取存活D組小鼠肝組織適量，提取DNA，采用基

3、因測(cè)序法檢測(cè)nrf2基因啟動(dòng)子-336位點(diǎn)的基因序列，分為非突變組
　　 (-336T)(D1組=7只)及突變組(-336C)(D2組=194只)。
　　 2．觀察各組小鼠在感染創(chuàng)傷弧菌后的體溫、呼吸、精神狀態(tài)等情況的改變，光鏡下觀察各組小鼠肝組織病理變化，隨機(jī)取酒精肝病感染VV組(D組)和正常感染VV組（C組）小鼠各10只，無(wú)菌取血后予常規(guī)血培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌。
　　 3．采用基因測(cè)序法檢測(cè)D組小鼠nrf2基因啟動(dòng)子

4、-336位點(diǎn)上非突變組(D1組)與突變組（D2組）；通過(guò)WesternBlot法檢測(cè)nrf2蛋白的表達(dá)；RT-PCR方法分別檢測(cè)各組小鼠肝組織nrf2，HMGB1，TNF-α，IL-10基因的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)HMGB1，TNF-α，IL-10組織中蛋白的表達(dá)。
　　 4．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以中位數(shù)(Median)和四分位間距(QR)來(lái)表示，應(yīng)用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩個(gè)和多個(gè)樣本比較采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)（兩樣本Mann-Wh

5、itney、多樣本Kruskal-Wal1isH法）進(jìn)行分析，P＜0.05及P＜0.05/3為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1．酒精肝病小鼠在感染VV后3h出現(xiàn)活動(dòng)減少，進(jìn)食飲水減少，6h后皮溫升高，肢端及口唇發(fā)紺明顯，精神萎靡，反應(yīng)明顯變慢，呼吸急促，豎毛現(xiàn)象，隨著時(shí)間的推延，四肢遠(yuǎn)端呈暗紫色，不能承力，行走時(shí)前述癥狀加重，染菌后48h血培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌為陽(yáng)性。
　　 2．基因測(cè)序法對(duì)201只酒精肝病感

6、染VV小鼠進(jìn)行nrf2基因啟動(dòng)子下游-336位點(diǎn)進(jìn)行基因序列檢測(cè)，其中有7只小鼠在該位點(diǎn)的基因序列為A，即上游序列為T(mén)(D1組)，194只小鼠在該位點(diǎn)的基因序列為G，即上游序列為C(D2組)。
　　 3．感染創(chuàng)傷弧菌48小時(shí)后，D1組酒精肝小鼠肝組織nrf2mRNA的表達(dá)是0.746(0.288)，D2組酒精肝小鼠肝組織nrf2mRNA的表達(dá)是0.352(0.156).與D1組比較，明顯降低(P＜0.05/3)；A1組小鼠肝組織

7、nrf2mRNA的表達(dá)是0.115(0.018)，D1組、D2組與A1組分別比較，均明顯增高(P＜0.05/3)；B1組酒精肝小鼠肝組織nrf2mRNA的表達(dá)是0.173(0.053)，D1組、D2組與B1組分別比較，均明顯增高(P＜0.05/3)。
　　 4．感染創(chuàng)傷弧菌48小時(shí)后，D1組酒精肝小鼠肝組織nrf2蛋白的表達(dá)是3.982(2.407)，D2組酒精肝小鼠肝組織nrf2蛋白的表達(dá)是2.243(1.311)，與D1組比

8、較，明顯降低(P＜0.05/3)；A1組小鼠肝組織nrf2蛋白的表達(dá)是0.908(0.580)，D1組、D2組與A1組比較，明顯增高（P＜0.05/3）；B1組酒精肝小鼠肝組織nrf2蛋白的表達(dá)是1.461(0.501)，D1組、D2組與B1組比較，明顯增高(P＜0.05/3)。
　　 5．感染創(chuàng)傷弧菌48小時(shí)后，D1組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達(dá)是0.508(0.294)、0.399(0.1

9、37)、1.825(0.656)，D2組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達(dá)是1.021(0.551)、0.699(0.166)、1.403(0.518)，與D1組比較，HMGB1、TNF-α明顯增高，IL-10明顯降低(P＜0.05/3)；A1組小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達(dá)是0.230(0.107)、0.140(0.057)、0.338(0.121)，D1組、D2組與A1組分別

10、比較，均明顯增高(P＜0.05/3)；B1組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達(dá)是0.410(0.152)、0.254(0.080)、0.637(0.157)，D1組與B1組比較，HMGB1無(wú)明顯差別(P＞0.05/3)，TNF-α、IL-10明顯增高(P＜0.05/3):D2組與B1組比較，HMGB1、TNF-α、IL-10，明顯增高(P＜0.05/3)。
　　 6．感染創(chuàng)傷弧菌48小時(shí)后，D1組酒

11、精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達(dá)是6.24(1.64)、174.60(50.52)、57.98(19.55)，D2組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達(dá)是12.89(3.74)、266.11(55.41)，41.53(8.35)與D1組比較，HMGB1、TNF-α明顯增高，IL-10明顯降低(P＜0.05/3)；A1組小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達(dá)是2.01(1.

12、21)、114.07(24.42)、13.97(6.45)，D1組、D2組與A1組比較，明顯增高（P＜0.05/3）；B1組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達(dá)是6.05(1.84)、142.94(33.89)、22.54(7.58)，D1組與B1組比較，HMGB1無(wú)明顯差別(P＞0.05/3)，TNF-α、IL-10明顯增高(P＜0.05/3)；D2組與B1組比較，HMGB1、TNF-α、IL-10，明顯增高(

13、P＜0.05/3)。
　　 7．光鏡下A1組肝小葉完整，肝細(xì)胞條索清晰，匯管區(qū)無(wú)擴(kuò)張；與A1組比較，B1組可見(jiàn)大量脂肪滴，空泡樣和氣球樣改變；C組可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝匯管區(qū)擴(kuò)張；D組肝小葉完整性破壞，匯管區(qū)可見(jiàn)擴(kuò)張的肝管和靜脈，肝細(xì)胞條索紊亂。
　　 結(jié)論：
　　 nrf2基因啟動(dòng)子上游-336位點(diǎn)T→C突變使酒精性肝病C57B6小鼠體內(nèi)nrf2表達(dá)明顯降低，并加劇酒精性肝病C57B6小鼠在感染創(chuàng)傷弧菌時(shí)的炎癥反