奶牛FCGRT基因啟動子多態(tài)性及激素對FcRn表達(dá)影響的研究.pdf

1、本試驗由四部分組成，主要研究了中國荷斯坦奶牛FcRn受體α鏈基因(FCGRT)啟動子基因多態(tài)性以及體外激素處理對FcRn mRNA表達(dá)豐度的影響。以PCR-SSCP方法發(fā)現(xiàn)的SNP位點為研究對象，從構(gòu)建不同單倍型熒光素酶報告基因載體和分析乳腺內(nèi)FcRn mRNA表達(dá)豐度兩個方面研究了啟動子多態(tài)性對轉(zhuǎn)錄活性的影響。并且，通過體外激素處理培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，為進(jìn)一步研究乳腺內(nèi)FcRn受體變化以及影響因素提供了依據(jù)。
　　 試驗一

2、：以189頭中國荷斯坦奶牛為研究對象，對FCGRT啟動子采用PCR-SSCP方法進(jìn)行多態(tài)性檢測。結(jié)果表明：FCGRT動子在P1、P2和P3引物擴增片段中存在PCR-SCP多態(tài)性，位于引物P1擴增產(chǎn)物有AA、AB、BB3種基因型，其頻率分別為25.40％、59.26％、15.34％；引物P2擴增產(chǎn)物有CC、CD、DD3種基因型，其頻率分別為20.63％、56.61％、22.75％；引物P3擴增產(chǎn)物有EE、EF、FF3種基因型，其頻率分別為

3、1.59％、12.17％、86.24％。經(jīng)克隆測序分析，在三個片段上分別發(fā)生了T→C、C→A、G→T的堿基序列突變。經(jīng)x2適合性檢驗，除SNP1外，中國荷斯坦奶牛在該基因位點上的SNP2和SNP3均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。
　　 試驗二：構(gòu)建奶牛FCGRT基因啟動子3種不同單倍型熒光素酶報告載體并在293細(xì)胞中檢測其轉(zhuǎn)錄活性。根據(jù)奶牛FCGRT基因啟動子區(qū)2個單個核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點C-1116T和C-

4、756A，構(gòu)建出3種單倍型(CC、CA和TA)。分別以CC/CC、CA/CA和TA/TA3種基因型的奶?；蚪MDNA為模板，用PCR法擴增出包含啟動子兩個SNP位點的長1789bp的DNA片斷，利用KpnI/BgI11雙酶切，純化回收后分別與同樣雙酶切的熒光素酶報告基因載體PGL3-Basic相連接，構(gòu)建CC-PGL3-Basic、CA-PGL3-Basic、TA-PGL3-Basic3個表達(dá)載體，并測序驗證其DNA序列。用電穿孔方法將

5、報告基因載體轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)評估不同單倍型FCGRT啟動子活性。結(jié)果表明，試驗成功構(gòu)建含有牛FCGRT基因啟動子3種不同單倍型DNA序列的真核表達(dá)載體，單倍型CC-PGL3-Basic載體相對熒光檢測值顯著高于單倍型CA-PGL3-Basic和CA-PGL3-Basic的相對熒光值，單倍型CA-PGL3-Basic相對熒光值又顯著高于單倍型TA-PGL3-Basic(P＜0.05)。FCGRT啟動子不同單倍型

6、載體表達(dá)存在差異，SNP影響了FCGRT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。奶牛FCGRT因啟動子不同單倍型的真核表達(dá)載體成功構(gòu)建，為FCGRT因啟動子功能研究和轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 試驗三：采集健康中國荷斯坦奶牛乳腺組織，通過測序檢測FCGR啟動子單核苷酸多態(tài)性，分析各單倍型對表達(dá)水平影響，研究中國荷斯坦奶牛FCGRT啟動子SNP對FcRn mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，不同單倍型中國荷斯坦奶牛乳腺內(nèi)FcRn mRNA表達(dá)水平明顯不同

7、。FCGRT啟動子單倍型C-C奶牛乳腺中FcRn表達(dá)最高，顯著高于單倍型T-A和C-A(P＜0.05)。單倍型C-A乳腺組織FcRn表達(dá)量顯著高于單倍型T-A(P＜0.05)。FCGRT啟動子SNP對FcRn的mRNA的表達(dá)有一定的影響，可能會進(jìn)一步的影響乳腺中FcRn的表達(dá)以及對IgG的轉(zhuǎn)運。
　　 試驗四：以中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究工具，采用了RT-PCR方法檢測激素處理對FcRn mRNA表達(dá)的影響。本文測定了體外

8、培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞時，添加不同濃度甲狀腺素T4(0、0.01、0.1、1μmol/L)、胰島素(0、0.005、0.1、0.5μmol/L)、胰高血糖素(0、0.01、0.1、1μmol/L)對FcRn mRNA的表達(dá)的影響。試驗結(jié)果表明：隨著激素添加劑量的增加，甲狀腺素和胰高血糖素能夠顯著的促進(jìn)表達(dá)量升高(P＜0.05)，而胰島素添加后FcRn基因mRNA的表達(dá)先升高后降低(P＜0.05)。因此，添加外源胰島素、胰高血糖素和甲狀腺素能夠