TGF-β1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在糖尿病肺細(xì)胞外基質(zhì)改變中的作用及GLP-1對其干預(yù)效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：糖尿病是一種以高血糖為特征的全身性代謝綜合征，其所致各組織、器官的多種慢性并發(fā)癥是影響糖尿病患者生活質(zhì)量以及致死、致殘的主要原因。長期以來，人們對糖尿病心臟、腎臟、神經(jīng)以及視網(wǎng)膜等并發(fā)癥進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。然而，有關(guān)糖尿病對肺臟的影響研究甚少。前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠肺細(xì)胞外基質(zhì)異常，肺間質(zhì)可見促纖維化細(xì)胞因子--轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達(dá)顯著增加。糖尿病肺細(xì)胞外基質(zhì)的改變是否與TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度激活

2、有關(guān)尚不清楚。國內(nèi)外有文獻(xiàn)報道，應(yīng)用胰高血糖素樣肽(GLP)-1治療可使自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型(OLETF)大鼠肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜厚度明顯降低，db/db小鼠腎臟TGF-β1、Ⅳ型膠原纖維表達(dá)顯著減少。GLP-1是否可降低肺成纖維細(xì)胞TGF-β1分泌，進(jìn)而下調(diào)FGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，改善糖尿病肺細(xì)胞外基質(zhì)的改變尚未見報道。本研究旨在探討TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在糖尿病肺細(xì)胞外基質(zhì)改變中的作用及GLP-1是否

3、可通過影響肺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，改善肺細(xì)胞外基質(zhì)，初步探索GLP-1在改善糖尿病肺功能異常中的作用。為人們深入了解糖尿病肺功能異常的發(fā)病機制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.4周齡OLETF大鼠12只和其同系非糖尿病對照組LETO大鼠8只，在無特定病原體級條件下單籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料。大鼠定期行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。至30周齡，共有成模OLETF大鼠8只。繼續(xù)飼養(yǎng)至42周齡，

4、經(jīng)股動脈放血處死大鼠，留取肺組織。
　　 ①HE、Masson染色觀察各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)和膠原纖維沉積情況；
　　 ②western blotting檢測各組大鼠肺組織Smad3、Smad7、Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)；
　　 ③ELISA檢測各組大鼠肺組織TGF-β1的表達(dá)。
　　 2.培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞系(MRC-5)。首先，
　　 ①RT-PCR檢測MRC-5細(xì)胞GLP-1受體(GLP-1R)mR

5、NA表達(dá)；
　　 ②提取MRC-5細(xì)胞膜蛋白，westernblotting檢測GLP-1R蛋白表達(dá)，印證MRC-5細(xì)胞是GLP-1作用的靶細(xì)胞。然后，在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，分別給予GLP-1(10nmol/L)干預(yù)24、48、72h后提取MRC-5細(xì)胞總mRNA和蛋白。
　　 3.
　　 ①實時熒光定量PCR檢測各組MRC-5細(xì)胞FN、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)；
　　 ②western bl

6、otting檢測各組MRC-5細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3(p-Smad3)、Smad7、纖維連接蛋白(FN)、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)；
　　 ③ELISA檢測各組MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.OLETF大鼠較LETO大鼠肥胖，活動遲緩、懶動、毛色干枯無光澤。成模及實驗結(jié)束時同周齡LETO大鼠體重、OGTT0-120min血糖曲線下面積、OGTT同步胰島素曲線下面積均低于OLET

7、F大鼠(P<0.05)。
　　 ①OHE染色顯示LETO大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，OLETF大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管壁、肺泡壁增厚，肺泡上皮細(xì)胞顯示不清，肺泡萎縮、塌陷，肺間質(zhì)和血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)增多，成纖維細(xì)胞增多，并有炎癥細(xì)胞浸潤。
　　 ②Masson染色顯示LETO大鼠肺間質(zhì)、血管周圍有少量膠原纖維。OLETF大鼠肺間質(zhì)膠原纖維增多，排列紊亂，毛細(xì)血管周圍膠原纖維增多。
　　 ③OLETF大鼠肺組織TGF-β1

8、、Smad3、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著高于LETO大鼠，Smad7蛋白表達(dá)顯著低于LETO大鼠(均P<0.05)。OLETF大鼠肺組織TGF-β1與Smad3呈顯著正相關(guān)(γ=0.853，P<0.05)，與Smad7呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.720，P<0.05)。
　　 2.在MRC-5細(xì)胞中檢測到GLP-1RmRNA表達(dá)，在其膜蛋白中檢測到GLP-1R蛋白表達(dá)。高糖狀態(tài)下MRC-5細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3蛋白以及FN、Ⅲ型膠原

9、纖維mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增高，Smad7蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中的TGF-β1達(dá)亦顯著增高(均P<0.05)；給予GLP-1干預(yù)后，上述各檢測指標(biāo)均得以逆轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.高血糖可能過度激活了OLETF大鼠肺組織TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致膠原纖維生成增加，細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂。
　　 2.GLP-1可能通過下調(diào)TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑