腎康丸對糖尿病腎病TGF-β-,1--Smad信號通路的影響.pdf

1、糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)患者臨床常見而難治的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)和DM患者死亡的主要原因。約40％的1型DM和5～20％的2型DM患者可以發(fā)生DN。隨著人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變，DM的發(fā)病率在全球迅速上升，DN的發(fā)病率也在不斷上升。因此，如何有效地預(yù)防、治療DN已成為醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的問題。 DM可由多種途徑損害腎臟，并累及腎臟的所有結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎小球細(xì)胞增殖、肥大，基底膜增厚和進(jìn)行性細(xì)胞外基

2、質(zhì)(ECM)堆積，最終導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是一種多功能的細(xì)胞因子，在DN發(fā)病中起著非常重要的作用。包括：促使腎臟固有細(xì)胞發(fā)生增殖、肥大，增加系膜細(xì)胞(MC)合成和分泌ECM，并通過增加基質(zhì)降解酶抑制物活性而減少ECM的降解等方面作用。Smad蛋白是是TGF-β1與其細(xì)胞表面絲/蘇氨酸激酶受體結(jié)合后，將其信號從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核過程中極其重要的細(xì)胞內(nèi)信號介導(dǎo)分子。在哺乳動物細(xì)胞中，其家族可分為3

3、大類：一是受體激活型Smad(R-Smads)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和可能的Smad8和Smad9；二是共同通路型Smad(Co-Smad)即Smad4；三是抑制型Smad(I-Smad)，包括Smad6和Smad7。其中參與TGF-β1信號傳導(dǎo)的Smad蛋白主要包括Smad2、Smad3、Samd4和Smad7。TGF-β1/Smad信號通路在介導(dǎo)ECM代謝異常，促進(jìn)DN發(fā)病中起著重要的作用。 西

4、醫(yī)在治療DN上主要是控制高血糖、減少蛋白尿、控制高血壓等對癥治療，但迄今為止尚沒有一個能完全阻斷DN進(jìn)展的藥物。因此，發(fā)揮中醫(yī)藥治療DN的優(yōu)勢和特色，積極探求中醫(yī)藥治療DN的有效方法，防止或延緩其發(fā)展具有重要的意義。 DN屬于中醫(yī)的“腎消”、“水腫”、“腎勞”、“關(guān)格”等范疇。脾腎虛是DN的發(fā)病基礎(chǔ)，痰濕、濁毒、瘀血等是其發(fā)展過程中的促進(jìn)因素，本虛標(biāo)實(shí)是DN的病機(jī)特點(diǎn)。DN早期(Ⅰ～Ⅲ期)多表現(xiàn)陰虛或氣陰兩虛；DN臨床期(Ⅳ期)

5、多表現(xiàn)脾腎虧虛、水濕內(nèi)?；驃A瘀血阻絡(luò)；DN終末期(Ⅴ期)多表現(xiàn)脾腎陰陽衰敗、濁毒中阻。因此，對Ⅲ～Ⅳ期DN的治療上以益氣健脾、滋腎養(yǎng)陰兼活血通絡(luò)為法。中藥復(fù)方制劑腎康丸由黃芪、芡實(shí)、金櫻子、水蛭、益母草等藥物組成，功能益氣健脾、補(bǔ)腎固澀，利尿消腫，活血通絡(luò)，暗合Ⅲ～Ⅳ期DN的病因病機(jī)，具有標(biāo)本兼治之功。腎康丸作為醫(yī)院制劑，在臨床治療DN患者多年，療效確切。臨床觀察和動物實(shí)驗(yàn)研究都表明，該藥在一定程度上可改善DN一般癥狀，保護(hù)腎臟，延緩D

6、N的進(jìn)展。但其治療DN的細(xì)胞分子水平的作用機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。因此，本課題通過動物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從TGF-β1/Smad信號通路出發(fā)，探討了腎康丸治療DN的細(xì)胞分子基因水平的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體如下： 第1章腎康丸對DN大鼠腎保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察腎康丸對DN大鼠模型的治療及腎臟保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究藥物作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：首先用鏈脲佐菌素(STZ)按65mg·kg-

7、1大鼠體重一次性腹腔內(nèi)注射法建立大鼠DM模型，連續(xù)2周，測血糖、尿糖、尿量，若血糖值高于16.7mmol·L-1、尿糖(+++)以上、尿量增加1倍以上，則造模成功，計算成模率。模型成功后隨機(jī)分為3組：模型對照組、開搏通組、腎康丸組，另設(shè)正常對照組(n=8只)。灌胃給藥治療8周，治療期間及治療后觀察大鼠一般狀況、血糖、尿糖。末次給藥后將大鼠放入代謝籠中，計24h尿量和飲水量。然后用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動脈穿刺采血，分離血清，檢

8、測大鼠血糖、糖化血紅蛋白(GHb)、24h尿蛋白總量(Upro)、24h尿白蛋白量(Ualb)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)、內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)；取大鼠腎臟，觀察腎臟大小，計算腎重、相對腎重，并通過HE、Masson染色法和電鏡觀察大鼠腎臟組織病理變化。 結(jié)果：32只大鼠用于造模，成模率84.40％(27/32)，成模后病死率7.4％(2/27)。在治療期間的8周里，模型組大鼠血糖均維持在16.7m

9、mol·L-1以上，尿糖+++以上；表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的DM癥狀；與正常大鼠比較，GHb、SCr、BUN、Ccr、24hUpro、24hUalb等指標(biāo)均升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；腎臟重量及相對腎重增加，具有顯著性意義(P＜0.01)，且出現(xiàn)了相當(dāng)于Mogensen分期的3期左右DN病理損害。與模型組大鼠比較，腎康丸和開搏通都可以改善大鼠基本狀況，降低上述指標(biāo)水平(開搏通組除外血糖指標(biāo))，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01

10、或P＜0.05)，減輕腎臟組織病理損害。 結(jié)論：腎康丸具有治療DN大鼠，保護(hù)大鼠腎臟的作用。 第2章腎康丸對DN大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路的影響 目的：探討腎康丸對DN大鼠TGF-β1/Smad信號通路的的影響。 方法：取第1章各對照及治療組大鼠腎臟，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法觀察各組大鼠腎臟組織纖連蛋白(FN)和TGF-β1mRNA基因表達(dá)情況；采用免疫組化法觀察各組大鼠腎

11、臟組織FN、TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7蛋白表達(dá)的情況。 結(jié)果：DN模型組大鼠與正常大鼠比較，腎臟組織中FN和TGF-β1mRNA基因表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，F(xiàn)N、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)明顯增加，而Smad7蛋白表達(dá)明顯降低。與模型組大鼠比較，腎康丸和開搏通都可以抑制DN大鼠腎臟組織中FN和TGF-β1mRNA基因表達(dá)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，減少FN、TGF-β1、Sma

12、d2、Smad3蛋白的表達(dá)，增加Smad7蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：腎康丸可以抑制DN大鼠腎臟中TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路的激活，減少ECM的合成和分泌，從而延緩DN進(jìn)程。 第3章腎康丸對高糖培養(yǎng)的MC增殖和細(xì)胞周期的影響 目的：探討腎康丸對體外高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞(MC)及細(xì)胞周期的影響，為下一步分子作用機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：16只大鼠隨機(jī)分為4組，正常大鼠血清組、開搏通組、腎康丸大小劑量組。

13、大鼠灌服相應(yīng)的藥物7天后，分離藥物血清。體外培養(yǎng)大鼠MC，分別用正常濃度葡萄糖和不同高濃度葡萄糖(20，30和40mmol·L-1)刺激24、48、72和96小時后，MTT法測細(xì)胞增殖。另將高糖(30mmol·L-1)培養(yǎng)的MC分為5組：高糖對照組、正常大鼠血清對照組、開搏通組及腎康丸高低劑量組。另設(shè)正常葡萄糖組。培養(yǎng)72小時后，采用MTT法測定各組細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果：與正常葡萄糖組比較，20mmol·L-

14、1葡萄糖在實(shí)驗(yàn)的96h里能促進(jìn)MC增殖，但僅在72h和96h具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。30mmol·L-1葡萄糖在實(shí)驗(yàn)的24h至96h里均能促進(jìn)MC增殖，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，72h內(nèi)隨著作用時間的延長，促進(jìn)增殖作用越明顯，72h后作用減弱，但仍有統(tǒng)計學(xué)意義。40mmol·L-1濃度的葡萄糖在48h內(nèi)對MC增殖有促進(jìn)作用，具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，48h后作用減弱，甚至轉(zhuǎn)為抑制。 結(jié)論：高糖可以

15、誘導(dǎo)MC增殖和細(xì)胞周期紊亂；腎康丸可以抑制高糖誘導(dǎo)的MC增殖，調(diào)整細(xì)胞周期。 第4章腎康丸對高糖培養(yǎng)MC細(xì)胞外基質(zhì)和TGF-β1/Smad信號通路的影響 目的：探討腎康丸對高糖培養(yǎng)MC細(xì)胞外基質(zhì)和TGF-β1/Smad信號通路的影響。 方法：將體外高糖(30mmol·L-1)培養(yǎng)的MC分為5組：高糖對照組、正常大鼠血清對照組、開搏通組及腎康丸高低劑量組。另設(shè)正常葡萄糖組。培養(yǎng)72h后，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELIS

16、A)法檢測各組MC培養(yǎng)上清FN和TGF-β1含量；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法觀察各組MC細(xì)胞中FN和TGF-β1mRNA基因表達(dá)情況；采用Westernblot法檢測各組MC細(xì)胞中Smad2、Smad3和Smad7蛋白表達(dá)的情況。 結(jié)果：與正常葡萄糖組比較，高糖培養(yǎng)組MC細(xì)胞上清中FN和TGF-β1含量增加，MC細(xì)胞中FN和TGF-β1mRNA基因表達(dá)上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Smad2和Smad3蛋白

17、表達(dá)增加，而Smad7蛋白表達(dá)降低。腎康丸和開搏通治療后可以降低高糖誘導(dǎo)的FN和TGF-β1分泌量和mRNA基因表達(dá)的增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；減少Smad2和Smad3蛋白的表達(dá)，增加Smad7蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：高糖可以激活MC中TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)MC合成和分泌ECM增加；腎康丸可以抑制高糖激活MC細(xì)胞中TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路，減少ECM的合成和分泌。 全文結(jié)論：本研究通