sFRP4在常染色體顯性遺傳性多囊腎中介導Wnt-β-catenin信號通路和PI3K-AKT信號通路誘導凋亡的作用.pdf

1、目的：研究分泌型卷曲相關蛋白4（sFRP4）在常染色體顯性遺傳性多囊腎?。ˋDPKD）中的表達及其引發(fā)細胞凋亡的機制。
　　方法：1.體內(nèi)實驗：（1）血標本實驗：收集12例正常人和20例已確診ADPKD患者的血漿，ELISA法檢測血漿sFRP4的水平。（2）組織學實驗：取對照腎組織和ADPKD腎組織各3例。免疫組織化學法觀察sFRP4在腎臟中的表達；TUNEL法檢測腎組織中細胞凋亡；RT-PCR法檢測人腎組織中 sFRP4 mRN

2、A、caspase-3 mRNA、GSK3βmRNA、β-catenin mRNA、cyclind1 mRNA水平；Western blot法檢測腎組織中sFRP4、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、cyclind1、AKT、p-AKT蛋白表達水平。（3）斑馬魚實驗：斑馬魚受精卵內(nèi)顯微注射200pg sFRP4 mRNA，55h后光鏡下

3、觀察sFRP4過表達后斑馬魚原腎囊腫形成情況。2.體外實驗（細胞學實驗）：HEK-293T細胞分為正常對照組、PcDNA6對照組和sFRP4組，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率；Western blot法檢測cleaved-caspase-3、pro-caspase-3蛋白表達情況。HEK-293T細胞分為對照組、Wnt3α組和Wnt3α+sFRP4共轉(zhuǎn)染組，Western blot法檢測β-catenin、p-AKT、AKT、NF-κB、

4、Bax、cleaved-caspase9、pro-caspase9蛋白表達水平。
　　結(jié)果：1.ADPKD患者血漿中sFRP4水平顯著高于健康人。2.相比對照組，免疫組化法觀察到sFRP4在ADPKD患者腎小管上皮細胞胞漿中表達明顯升高。3.TUNEL法檢測結(jié)果示腎小管上皮細胞凋亡增加。4.ADPKD腎組織中sFRP4、caspase-3、β-catenin、cyclind1 mRNA水平均高于對照組，而GSK3βmRNA水平下降

5、。Western blot結(jié)果表明 sFRP4、cleaved-caspase-3、p-GSK3β、β-catenin、cyclind1蛋白表達高于對照組，而GSK3β、p-β-catenin、p-AKT/AKT低于對照組。5.斑馬魚受精卵內(nèi)注射sFRP4 mRNA后可見原腎囊腫形成。6.HEK-293T細胞過表達sFRP4，可致細胞凋亡率增加，凋亡相關蛋白Bax、cleaved-caspase9、cleaved-caspase-3表達