1、前言：
胃癌(GC)是一個(gè)重要的全球衛(wèi)生問(wèn)題，并且是第四最常見(jiàn)的惡性腫瘤，而發(fā)病率和死亡率居世界第二。越來(lái)越多的研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與表遺傳學(xué)密切相關(guān)，尤其是組蛋白修飾和DNA甲基化，并且基因啟動(dòng)子甲基化常與H3K9甲基化共同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。隨著芯片技術(shù)日新月異的發(fā)展，基因芯片應(yīng)用的領(lǐng)域更為廣泛，有研究曾應(yīng)用CGI微陣列芯片配合H3K9甲基化和乙?；贵w來(lái)識(shí)別表遺傳學(xué)沉默的目標(biāo)基因，得到了良好效果。我們團(tuán)隊(duì)之前的研究也使用這
2、種芯片技術(shù)于胃癌細(xì)胞株中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)基因NLK(Nemo-like kinase)很可能在胃癌中存在表觀遺傳沉默現(xiàn)象，所以就此進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究。
NLK基因是學(xué)者研究紅鰭東水魨神經(jīng)纖維瘤病1型基因時(shí)在其5'非編碼區(qū)偶然發(fā)現(xiàn)的，其與Nemo基因相似，所以命名為Nemo-like kinase。NLK分兩個(gè)亞型即為NLK1和NLK2。NLK1主要存在于爪蟾和斑馬魚(yú)中;NLK2主要存在于包括鼠類和人類在內(nèi)的許多不同物種，所以下
3、文提及的NLK實(shí)為NLK2。研究表明NLK定位主要為細(xì)胞核，在成人大腦中呈高表達(dá)水平，而在心、腎、肝和肺臟器中呈穩(wěn)定的低表達(dá)狀態(tài)。NLK在很多信號(hào)通路中發(fā)揮作用，但最為重要的是Wnt通路。研究證明，NLK能夠通過(guò)負(fù)向調(diào)控經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
一些獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)NLK基因在前列腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、結(jié)腸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等存在表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是，NLK在胃癌中表
4、達(dá)以及功能情況尚不清楚。
目的：
本研究首先檢測(cè)NLK在胃癌中的表達(dá)情況，探討其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及臨床病理學(xué)的關(guān)系，進(jìn)一步研究其分子調(diào)節(jié)機(jī)制，探討研究結(jié)果是否可以為臨床提供新的治療思路。第一部分，本部分研究首先檢測(cè)了胃癌細(xì)胞NLK的表達(dá)水平，然后檢測(cè)NLK啟動(dòng)子基因甲基化及H3K9甲基化與乙?；剑瑥亩治鑫赴┘?xì)胞系中NLK表達(dá)水平與DNA甲基化及H3K9甲基化與乙?；年P(guān)系;第二部分，本部分研究首先通過(guò)體
5、外實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用去甲基化制劑與去乙?；苿┳饔糜谖赴┘?xì)胞株，觀察NLK表達(dá)水平變化，然后檢測(cè)NLK啟動(dòng)子基因甲基化及H3K9甲基化與乙?；阶兓M(jìn)一步分析這些變化與藥物干預(yù)間存在的關(guān)系;然后應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默NLK高表達(dá)胃癌細(xì)胞株，檢測(cè)其增殖和侵襲能力的變化情況，并應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)NLK基因沉默后NLK蛋白與β-catenin蛋白水平變化及二者的關(guān)系;第三部分，本部分研究首先檢測(cè)胃癌組織與配對(duì)正常組織中NLK基
6、因的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平，然后檢測(cè)其NLK啟動(dòng)子區(qū)基因甲基化水平，分析胃癌組織與配對(duì)正常組織中NLK表達(dá)水平及甲基化水平的關(guān)系，并進(jìn)一步探討NLK表達(dá)下調(diào)機(jī)制及其與臨床病理學(xué)資料的聯(lián)系，然后聯(lián)系第二部分藥物干預(yù)結(jié)果，由此探討5-Aza-dC藥物對(duì)NLK基因表達(dá)調(diào)控的意義及在胃癌臨床治療中的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
方法：
一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
選擇2009年4月～2010年6月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所行手術(shù)切除且
7、病理組織學(xué)檢查確診為胃癌的標(biāo)本40例;人胃癌細(xì)胞株BGC823、SGC7901、AGS、MKN45和胃粘膜永生化細(xì)胞株GES1.
二、實(shí)驗(yàn)方法
1、細(xì)胞培養(yǎng):BGC823、SGC7901、AGS、MKN45和GES1按常規(guī)培養(yǎng)。
2、qTR-PCR分別檢測(cè)NLK基因mRNA在組織和細(xì)胞水平中的表達(dá)情況。
3、Western blot檢測(cè)胃癌和癌旁組織中NLK蛋白表達(dá)含量，并檢測(cè)BGC823細(xì)胞株N
8、LK基因沉默后NLK蛋白與β-catenin蛋白水平變化。
4、MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞NLK表達(dá)沉默后細(xì)胞活力變化。
5、劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染致BGC-823細(xì)胞NLK表達(dá)沉默后細(xì)胞遷移與侵襲能力變化。
6、甲基化特異性PCR法檢測(cè)NLK啟動(dòng)子基因甲基化狀況;免疫共沉淀PCR法檢測(cè)NLK基因DNA啟動(dòng)子區(qū)H3K9甲基化與乙?；癄顟B(tài)。
7、應(yīng)用去甲基化與去乙酰化
9、制劑干預(yù)BGC823胃癌細(xì)胞株，檢測(cè)干預(yù)前后NLK基因表達(dá)、啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及H3K9甲基化狀態(tài)變化情況。
結(jié)果：
第一部分胃癌細(xì)胞系中NLK表達(dá)與DNA甲基化及H3K9甲基化和乙?；P(guān)系的研究
1、qRT-PCR結(jié)果顯示，NLK表達(dá)水平在4株胃癌細(xì)胞株與1株正常人胃粘膜永生化細(xì)胞株相比，均低于胃粘膜永生化細(xì)胞株GES1(P＜0.01)。然而，NLK于BGC823中的表達(dá)高于MKN45與SGC7901，低于
10、AGS。
2、甲基化特異性PCR檢測(cè)4株胃癌細(xì)胞株與1株胃粘膜永生化細(xì)胞株中NLK基因啟動(dòng)子甲基化情況，MKN45、BGC823顯示其啟動(dòng)子區(qū)甲基化;SGC7901為半甲基化，而AGS與GES1則顯示非甲基化。
3、免疫共沉淀PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NLK基因在胃癌細(xì)胞系SGC7901，BGC823及MKN45中，NLK基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9甲基化與DNA的甲基化正相關(guān)，即DNA甲基化程度高者，H3K9甲基化程度也高;半甲基化
11、者，H3K9甲基化程度中等;無(wú)甲基化者，H3K9甲基化程度很低;而H3K9乙酰化與DNA的甲基化負(fù)相關(guān)。
4、對(duì)4株胃癌細(xì)胞株應(yīng)用甲基化酶抑制劑5-Aza-dC和組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA處理72h。結(jié)果顯示單用5-Aza-dC可明顯提高NLK表達(dá)水平，而TSA單獨(dú)作用對(duì)NLK的表達(dá)影響不明顯。聯(lián)合應(yīng)用5-Aza-dC和TSA可使NLK的表達(dá)水平稍高于單用5-Aza-dC。
5、甲基化酶抑制劑5-Aza-dC可使N
12、LK啟動(dòng)子區(qū)H3K9甲基化水平降低，而乙?；种苿?duì)其無(wú)影響。而且，5-Aza-dC也可使H3K9甲基化狀態(tài)降低，H3K9甲基化與DNA的甲基化在基因的沉默機(jī)制中具有協(xié)同作用。
第二部分胃癌細(xì)胞中NLK表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的研究
1、選取NLK相對(duì)高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株BGC823，采用NLK特異干擾質(zhì)粒沉默其表達(dá)后，NLK的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降，然而β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高。<
13、br> 2、轉(zhuǎn)染致胃癌細(xì)胞株BGC823中NLK基因沉默后，其增殖率明顯變強(qiáng)。
3、轉(zhuǎn)染致胃癌細(xì)胞株BGC823中NLK基因沉默后，其侵襲與遷移能力均明顯增強(qiáng)。
第三部分胃癌組織中NLK基因mRNA表達(dá)及DNA甲基化狀態(tài)的臨床意義的研究
1、40例胃癌組織中NLK基因mRNA表達(dá)水平明顯低于配對(duì)的癌旁組織。胃癌組織NLK基因mRNA表達(dá)水平與浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)(P＜0.01);而與組織分化程
14、度、性別、年齡、腫瘤部位、大小、臨床病理分期等資料無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。
2、胃癌組織的Western blot結(jié)果證實(shí)NLK蛋白表達(dá)水平明顯低于配對(duì)的癌旁組織(P＜0.01)。
3、40例胃組織中，癌組織的甲基化水平明顯高于配對(duì)的癌旁正常組織，差異顯著(P＜0.01)，胃癌組織DNA甲基化與浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)(P＜0.01)，而與其它臨床病理學(xué)特征無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。
結(jié)論：<
15、br> 1、NLK在胃癌細(xì)胞株和組織均呈現(xiàn)表達(dá)水平下調(diào)，且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度密切相關(guān)。
2、NLK表達(dá)水平下調(diào)可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增值和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
3、NLK啟動(dòng)子區(qū)CpG島的DNA異常甲基化與相應(yīng)區(qū)域組蛋白H3K9甲基化是胃癌細(xì)胞及組織中NLK表達(dá)水平下調(diào)的主要機(jī)制。
4、5-Aza-dC可以降低NLK啟動(dòng)子區(qū)CpG島的DNA甲基化與相應(yīng)區(qū)域組蛋白H3K9甲基化水平，并可以提高胃癌細(xì)胞株中NL
