NLK基因表達與胃癌轉(zhuǎn)移及相關(guān)機制的研究.pdf

1、前言：
　　胃癌(GC)是一個重要的全球衛(wèi)生問題，并且是第四最常見的惡性腫瘤，而發(fā)病率和死亡率居世界第二。越來越多的研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與表遺傳學密切相關(guān)，尤其是組蛋白修飾和DNA甲基化，并且基因啟動子甲基化常與H3K9甲基化共同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。隨著芯片技術(shù)日新月異的發(fā)展，基因芯片應用的領(lǐng)域更為廣泛，有研究曾應用CGI微陣列芯片配合H3K9甲基化和乙?；贵w來識別表遺傳學沉默的目標基因，得到了良好效果。我們團隊之前的研究也使用這

2、種芯片技術(shù)于胃癌細胞株中進行篩選，發(fā)現(xiàn)基因NLK(Nemo-like kinase)很可能在胃癌中存在表觀遺傳沉默現(xiàn)象，所以就此進行了全面系統(tǒng)的研究。
　　NLK基因是學者研究紅鰭東水魨神經(jīng)纖維瘤病1型基因時在其5'非編碼區(qū)偶然發(fā)現(xiàn)的，其與Nemo基因相似，所以命名為Nemo-like kinase。NLK分兩個亞型即為NLK1和NLK2。NLK1主要存在于爪蟾和斑馬魚中;NLK2主要存在于包括鼠類和人類在內(nèi)的許多不同物種，所以下

3、文提及的NLK實為NLK2。研究表明NLK定位主要為細胞核，在成人大腦中呈高表達水平，而在心、腎、肝和肺臟器中呈穩(wěn)定的低表達狀態(tài)。NLK在很多信號通路中發(fā)揮作用，但最為重要的是Wnt通路。研究證明，NLK能夠通過負向調(diào)控經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　一些獨立研究發(fā)現(xiàn)NLK基因在前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌、卵巢癌、結(jié)腸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等存在表達下調(diào)現(xiàn)象，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是，NLK在胃癌中表

4、達以及功能情況尚不清楚。
　　目的：
　　本研究首先檢測NLK在胃癌中的表達情況，探討其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及臨床病理學的關(guān)系，進一步研究其分子調(diào)節(jié)機制，探討研究結(jié)果是否可以為臨床提供新的治療思路。第一部分，本部分研究首先檢測了胃癌細胞NLK的表達水平，然后檢測NLK啟動子基因甲基化及H3K9甲基化與乙?；?，從而分析胃癌細胞系中NLK表達水平與DNA甲基化及H3K9甲基化與乙酰化的關(guān)系;第二部分，本部分研究首先通過體

5、外實驗研究應用去甲基化制劑與去乙?；苿┳饔糜谖赴┘毎?，觀察NLK表達水平變化，然后檢測NLK啟動子基因甲基化及H3K9甲基化與乙酰化水平變化，進一步分析這些變化與藥物干預間存在的關(guān)系;然后應用siRNA技術(shù)沉默NLK高表達胃癌細胞株，檢測其增殖和侵襲能力的變化情況，并應用Western blot技術(shù)檢測NLK基因沉默后NLK蛋白與β-catenin蛋白水平變化及二者的關(guān)系;第三部分，本部分研究首先檢測胃癌組織與配對正常組織中NLK基

6、因的mRNA表達水平及蛋白表達水平，然后檢測其NLK啟動子區(qū)基因甲基化水平，分析胃癌組織與配對正常組織中NLK表達水平及甲基化水平的關(guān)系，并進一步探討NLK表達下調(diào)機制及其與臨床病理學資料的聯(lián)系，然后聯(lián)系第二部分藥物干預結(jié)果，由此探討5-Aza-dC藥物對NLK基因表達調(diào)控的意義及在胃癌臨床治療中的潛在臨床應用價值。
　　方法：
　　一、實驗對象
　　選擇2009年4月～2010年6月中國醫(yī)科大學腫瘤研究所行手術(shù)切除且

7、病理組織學檢查確診為胃癌的標本40例;人胃癌細胞株BGC823、SGC7901、AGS、MKN45和胃粘膜永生化細胞株GES1.
　　二、實驗方法
　　1、細胞培養(yǎng):BGC823、SGC7901、AGS、MKN45和GES1按常規(guī)培養(yǎng)。
　　2、qTR-PCR分別檢測NLK基因mRNA在組織和細胞水平中的表達情況。
　　3、Western blot檢測胃癌和癌旁組織中NLK蛋白表達含量，并檢測BGC823細胞株N

8、LK基因沉默后NLK蛋白與β-catenin蛋白水平變化。
　　4、MTT法檢測轉(zhuǎn)染至BGC-823細胞NLK表達沉默后細胞活力變化。
　　5、劃痕實驗與Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染致BGC-823細胞NLK表達沉默后細胞遷移與侵襲能力變化。
　　6、甲基化特異性PCR法檢測NLK啟動子基因甲基化狀況;免疫共沉淀PCR法檢測NLK基因DNA啟動子區(qū)H3K9甲基化與乙?；癄顟B(tài)。
　　7、應用去甲基化與去乙?；?/p>

9、制劑干預BGC823胃癌細胞株，檢測干預前后NLK基因表達、啟動子甲基化狀態(tài)及H3K9甲基化狀態(tài)變化情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分胃癌細胞系中NLK表達與DNA甲基化及H3K9甲基化和乙?；P(guān)系的研究
　　1、qRT-PCR結(jié)果顯示，NLK表達水平在4株胃癌細胞株與1株正常人胃粘膜永生化細胞株相比，均低于胃粘膜永生化細胞株GES1(P＜0.01)。然而，NLK于BGC823中的表達高于MKN45與SGC7901，低于

10、AGS。
　　2、甲基化特異性PCR檢測4株胃癌細胞株與1株胃粘膜永生化細胞株中NLK基因啟動子甲基化情況，MKN45、BGC823顯示其啟動子區(qū)甲基化;SGC7901為半甲基化，而AGS與GES1則顯示非甲基化。
　　3、免疫共沉淀PCR法檢測發(fā)現(xiàn)NLK基因在胃癌細胞系SGC7901，BGC823及MKN45中，NLK基因啟動子區(qū)H3K9甲基化與DNA的甲基化正相關(guān)，即DNA甲基化程度高者，H3K9甲基化程度也高;半甲基化

11、者，H3K9甲基化程度中等;無甲基化者，H3K9甲基化程度很低;而H3K9乙酰化與DNA的甲基化負相關(guān)。
　　4、對4株胃癌細胞株應用甲基化酶抑制劑5-Aza-dC和組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA處理72h。結(jié)果顯示單用5-Aza-dC可明顯提高NLK表達水平，而TSA單獨作用對NLK的表達影響不明顯。聯(lián)合應用5-Aza-dC和TSA可使NLK的表達水平稍高于單用5-Aza-dC。
　　5、甲基化酶抑制劑5-Aza-dC可使N

12、LK啟動子區(qū)H3K9甲基化水平降低，而乙?；种苿ζ錈o影響。而且，5-Aza-dC也可使H3K9甲基化狀態(tài)降低，H3K9甲基化與DNA的甲基化在基因的沉默機制中具有協(xié)同作用。
　　第二部分胃癌細胞中NLK表達下調(diào)對胃癌細胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的研究
　　1、選取NLK相對高表達的胃癌細胞株BGC823，采用NLK特異干擾質(zhì)粒沉默其表達后，NLK的mRNA及蛋白表達水平明顯下降，然而β-catenin蛋白表達水平明顯升高。<

13、br>　　2、轉(zhuǎn)染致胃癌細胞株BGC823中NLK基因沉默后，其增殖率明顯變強。
　　3、轉(zhuǎn)染致胃癌細胞株BGC823中NLK基因沉默后，其侵襲與遷移能力均明顯增強。
　　第三部分胃癌組織中NLK基因mRNA表達及DNA甲基化狀態(tài)的臨床意義的研究
　　1、40例胃癌組織中NLK基因mRNA表達水平明顯低于配對的癌旁組織。胃癌組織NLK基因mRNA表達水平與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)(P＜0.01);而與組織分化程

14、度、性別、年齡、腫瘤部位、大小、臨床病理分期等資料無明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。
　　2、胃癌組織的Western blot結(jié)果證實NLK蛋白表達水平明顯低于配對的癌旁組織(P＜0.01)。
　　3、40例胃組織中，癌組織的甲基化水平明顯高于配對的癌旁正常組織，差異顯著(P＜0.01)，胃癌組織DNA甲基化與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)(P＜0.01)，而與其它臨床病理學特征無明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。
　　結(jié)論：<

15、br>　　1、NLK在胃癌細胞株和組織均呈現(xiàn)表達水平下調(diào)，且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度密切相關(guān)。
　　2、NLK表達水平下調(diào)可以增強胃癌細胞的增值和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　3、NLK啟動子區(qū)CpG島的DNA異常甲基化與相應區(qū)域組蛋白H3K9甲基化是胃癌細胞及組織中NLK表達水平下調(diào)的主要機制。
　　4、5-Aza-dC可以降低NLK啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化與相應區(qū)域組蛋白H3K9甲基化水平，并可以提高胃癌細胞株中NL