Edar基因敲除絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、基因打靶技術(shù)是20世紀(jì)80年代后半期興起的一種對(duì)生物遺傳信息精細(xì)改造的生物技術(shù)手段，本研究應(yīng)用基因打靶技術(shù)構(gòu)建Edar基因敲除絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞系。毛囊的周期性變化是多基因參與并緊密聯(lián)系和相互制約的復(fù)雜生理生化過(guò)程。絨山羊皮膚中的毛囊分為初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊，其中初級(jí)毛囊發(fā)育形成羊毛，而次級(jí)毛囊發(fā)育形成羊絨。其中Edar基因編碼初級(jí)毛囊發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)信號(hào)受體分子，Edar基因?qū)儆谀[瘤壞死因子超家族成員，目前只發(fā)現(xiàn)該基因與外胚層汗腺、毛

2、發(fā)、羽毛、及牙齒等發(fā)育有關(guān)。本研究通過(guò)應(yīng)用Cre-LoxP重組系統(tǒng)來(lái)對(duì)絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的Edar基因敲除，探討Edar基因?qū)q山羊毛囊發(fā)育的影響。
　　正確克隆了角蛋白14啟動(dòng)子(K14)，分別構(gòu)建了由K14啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)紅熒光蛋白(DsRed)基因的載體;將其轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞和初級(jí)毛乳頭細(xì)胞，經(jīng)篩選后分別得到轉(zhuǎn)染pK14-DsRed質(zhì)粒和pCMV-DsRed質(zhì)粒的六種陽(yáng)性細(xì)胞;以CMV啟動(dòng)子作為

3、對(duì)照通過(guò)real-timePCR方法檢測(cè)K14啟動(dòng)子啟動(dòng)紅色熒光蛋白表達(dá)的效率，發(fā)現(xiàn)K14啟動(dòng)子在山羊初級(jí)毛乳頭細(xì)胞、山羊表皮細(xì)胞中啟動(dòng)外源基因的啟動(dòng)效率高于在胎兒成纖維細(xì)胞中的啟動(dòng)效率，具有組織特異性。
　　正確克隆了絨山羊Edar基因的部分cDNA序列，并獲得了絨山羊Edar基因第12號(hào)外顯子兩翼各近4Kbp的基因組序列。選擇合適片段作為打靶載體的同源臂，其中上游同源臂為3058bp，下游同源臂為3765bp。成功構(gòu)建了pKn