Edar基因敲除絨山羊胎兒成纖維細胞系的構建.pdf

1、基因打靶技術是20世紀80年代后半期興起的一種對生物遺傳信息精細改造的生物技術手段，本研究應用基因打靶技術構建Edar基因敲除絨山羊胎兒成纖維細胞系。毛囊的周期性變化是多基因參與并緊密聯(lián)系和相互制約的復雜生理生化過程。絨山羊皮膚中的毛囊分為初級毛囊和次級毛囊，其中初級毛囊發(fā)育形成羊毛，而次級毛囊發(fā)育形成羊絨。其中Edar基因編碼初級毛囊發(fā)育過程中的一個信號受體分子，Edar基因屬于腫瘤壞死因子超家族成員，目前只發(fā)現(xiàn)該基因與外胚層汗腺、毛

2、發(fā)、羽毛、及牙齒等發(fā)育有關。本研究通過應用Cre-LoxP重組系統(tǒng)來對絨山羊胎兒成纖維細胞的Edar基因敲除，探討Edar基因對絨山羊毛囊發(fā)育的影響。
　　正確克隆了角蛋白14啟動子(K14)，分別構建了由K14啟動子和CMV啟動子來啟動紅熒光蛋白(DsRed)基因的載體;將其轉染絨山羊胎兒成纖維細胞、表皮細胞和初級毛乳頭細胞，經篩選后分別得到轉染pK14-DsRed質粒和pCMV-DsRed質粒的六種陽性細胞;以CMV啟動子作為

3、對照通過real-timePCR方法檢測K14啟動子啟動紅色熒光蛋白表達的效率，發(fā)現(xiàn)K14啟動子在山羊初級毛乳頭細胞、山羊表皮細胞中啟動外源基因的啟動效率高于在胎兒成纖維細胞中的啟動效率，具有組織特異性。
　　正確克隆了絨山羊Edar基因的部分cDNA序列，并獲得了絨山羊Edar基因第12號外顯子兩翼各近4Kbp的基因組序列。選擇合適片段作為打靶載體的同源臂，其中上游同源臂為3058bp，下游同源臂為3765bp。成功構建了pKn