同源重組敲除β-lactoglobulin基因的山羊耳組織成纖維細(xì)胞的構(gòu)建.pdf

1、基因敲除技術(shù)是利用同源重組,對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)精確遺傳修飾的一種方法。利用動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和動(dòng)物克隆技術(shù),再結(jié)合基因打靶技術(shù),人們開展了基因的定點(diǎn)修復(fù)、遺傳缺陷的治療、動(dòng)物不利基因的敲除失活等一系列的動(dòng)物基因組修飾的理論和應(yīng)用研究。這些技術(shù)也為動(dòng)物乳腺反應(yīng)器研究和提高表達(dá)率提供了重要幫助,為實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)整合及乳腺特異性表達(dá)尋找到途徑,無疑成為當(dāng)今動(dòng)物遺傳學(xué)研究的熱門和重點(diǎn)。
　　 β-乳球蛋白(β-lactoglobulin。BLG

2、)是嬰兒乳過敏癥的主要的過敏原之一。為了提高乳品質(zhì)量,消除乳汁中BLG過敏原顯得尤為重要。雖然當(dāng)前有針對(duì)降低BLG過敏癥的一些方法,但不能從根本上消除乳汁中的BLG,也就無法徹底地解決BLG的致敏性問題。本研究對(duì)山羊體細(xì)胞β-lactoglobulin基因敲除進(jìn)行了初步探索,研究的目的在于利用山羊BLG基因打靶載體,對(duì)山羊耳組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)基因敲除,然后經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和藥物正負(fù)篩選技術(shù),構(gòu)建敲除BLG基因的山羊耳組織成纖維細(xì)胞,為

3、生產(chǎn)乳汁中不含BLG的山羊新品種奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究共分兩部分,第一,利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)山羊耳組織成纖維細(xì)胞;第二,利用構(gòu)建的打靶載體,構(gòu)建敲除β-lactoglobulin基因的成纖維細(xì)胞。主要進(jìn)行了:(1)利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)山羊耳組織成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行了細(xì)胞凍存復(fù)蘇,測(cè)定了細(xì)胞活率和生長(zhǎng)曲線:(2)利用脂質(zhì)體法將打靶載體pBLG2T載體轉(zhuǎn)染入山羊耳組織成纖維細(xì)胞;(3)用G418和丙氧鳥苷對(duì)轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞

4、進(jìn)行了共計(jì)17d的正負(fù)藥物篩選;(4)PCR鑒定篩選得到的細(xì)胞克隆;(5)比較陽(yáng)性細(xì)胞和普通細(xì)胞的活力區(qū)別,并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞克隆進(jìn)行核型分析。研究結(jié)果如下:
　　 1.成功分離培養(yǎng)了山羊耳組織成纖維細(xì)胞。凍存前細(xì)胞存活率為97.0%,經(jīng)凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率為92.3%。細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線里“S”型,依次經(jīng)歷了潛伏生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。
　　 2.根據(jù)山羊耳組織成纖維細(xì)胞對(duì)G418的耐受分析結(jié)果和細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,選擇G418

5、濃度400μg/mL為初篩濃度,200μg/mL為維持濃度,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了7d的正篩選,然后用G418和GANC進(jìn)行了10d的負(fù)篩選,得到了12個(gè)細(xì)胞克隆。
　　 3.PCR法檢測(cè),結(jié)果顯示只有1號(hào)細(xì)胞克隆有neo基因條帶,并出現(xiàn)了預(yù)期的打靶條帶,初步認(rèn)為該克隆發(fā)生了預(yù)期的同源重組。該陽(yáng)性細(xì)胞克隆細(xì)胞核型穩(wěn)定,可以作為供體細(xì)胞。細(xì)胞活力顯著低于普通成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力(1.556±0.026vs1.726±0.036.P＜0.01