CRISPR-Cas9介導敲除內蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞FGF5基因.pdf

1、內蒙古白絨山羊是優(yōu)秀的絨山羊品種，產出高品質羊絨，在全球享有盛譽。提高羊絨產量一直是絨山羊品種選育的重要任務，分子育種為品種改良提供了新手段。RNA引導的CRISPR/Cas9核酸內切酶系統是近年發(fā)展起來的基因定點編輯技術，它通過一段短的RNA序列與DNA靶序列通過堿基互補原則形成雙鏈，后結合Cas9蛋白在DNA靶位點誘導形成雙鏈斷裂損傷(double-strandedbreak，DSBs)，DSBs修復時可以在基因組靶位點引入特殊的基

2、因突變，具有設計簡單，打靶效率高及能在靶位點形成多種突變的優(yōu)點。成纖維細胞生長因子5（fibroblast growth factor5，FGF5）是影響毛囊周期性活動及絨毛生長的重要生長因子，是一個已知的最強有力的控制毛囊從生長期向休止期轉化的因子。敲除FGF5基因可以解除對毛囊生長周期的控制，促進絨毛生長。
　　本文針對內蒙古自絨山羊FGF5基因設計了特異性的“向導RNA”分子（Single guide RNA，sgRNA），

3、并對該sgRNA的潛在脫靶位點進行預測，構建特異于內蒙古白絨山羊FGF5基因的CRISPR/Cas9表達載體，轉染胎兒成纖維細胞，在pool克隆水平上通過Surveyor錯配酶酶切pool克隆中的FGF5片段并測序驗證，以確定在FGF5基因靶位點發(fā)生了基因敲除。隨機挑取單個細胞培養(yǎng)，建立單克隆細胞系，對每個單克隆細胞系的基因組進行PCR擴增并測序，篩選出定點敲除FGF5基因的內蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞系。
　　結果表明:通過生物

4、信息學分析得到靶向于內蒙古白絨山羊基因組FGF5基因的79個潛在靶位點，從中選取了兩個sgRNA序列，分別命名為FGF5-1(AGAAGCGCCTCGCACCCAAA)和FGF5-2(CCCTGCCTCCTCCTCCTCCG)。將兩個sgRNA序列連接于pX330空載體，得到特異于白絨山羊基因組FGF5基因的CRISPR/Cas9表達載體——pX330-FGF5-1和pX330-FGF5-2。測序表明載體構建正確。
　　利用pX3

5、30-FGF5-1和pX330-FGF5-2轉染內蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞，Surveyor錯配酶酶切和測序驗證表明成功的在靶位點進行了特異性切割和突變。利用流式細胞儀通過隨機挑選得到24個單克隆細胞系，特異性擴增FGF5基因片段，測序結果表明其中4個細胞系在靶位點發(fā)生FGF5基因突變。對這4個敲除FGF5基因的陽性克隆細胞系進行潛在脫靶位點驗證，均未發(fā)生基因突變。
　　綜上所述，本文根據內蒙古白絨山羊FGF5基因的基因組序列設