利用鋅指核酶技術(shù)制備MSTN基因敲除的牛胎兒成纖維細(xì)胞.pdf

1、肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)是骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，其與肌纖維細(xì)胞的生長和數(shù)量密切相關(guān)。MSTN基因的缺失會造成肌肉過度肥大的現(xiàn)象，即所謂的“雙肌”現(xiàn)象，“雙肌”牛較普通牛產(chǎn)肉率可提高40％左右，但通過常規(guī)雜交育種培育“雙肌”牛，其育種周期長，遺傳性狀不穩(wěn)定，而通過基因打靶技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞核移植(Somaticcellnucleartransfer，SCNT)技術(shù)可克服此缺點。本實驗對牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)

2、化，利用鋅指核酶打靶載體對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)PCR產(chǎn)物測序鑒定MSTN敲除的陽性克隆細(xì)胞系，為MSTN基因功能的研究以及后續(xù)MSTN敲除牛的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　1、牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
　　利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1質(zhì)粒，對電穿孔法及脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染魯西黃牛胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，轉(zhuǎn)染48h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，最高轉(zhuǎn)染率分別為35.02±3.51％和44.06±0.30％，對應(yīng)的轉(zhuǎn)染條件分別

3、為500v電壓、4ms脈沖時間、3ug質(zhì)粒和2ul脂質(zhì)體、800ng質(zhì)粒，相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，統(tǒng)計學(xué)分析兩者無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2、利用鋅指核酶技術(shù)制備MSTN基因敲除的牛胎兒成纖維細(xì)胞
　　通過優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件，將購于Sigma-Aldrich公司的兩套鋅指核酶載體bMK-Ⅰ（包括bZFN-1、bZFN-2兩個質(zhì)粒）和bMK-Ⅱ（包括bZFN-3、bZFN-4兩個質(zhì)粒）分別導(dǎo)入魯西黃牛胎兒成纖維細(xì)

4、胞中，隨機(jī)挑取單細(xì)胞，建立單克隆細(xì)胞系，使用跨鋅指核酶作用位點的PCR引物對單克隆細(xì)胞系基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測序鑒定后，最終得到在鋅指核酶作用位點發(fā)生突變的單克隆細(xì)胞系。由電穿孔法介導(dǎo)打靶一次，獲得154個單克隆細(xì)胞系，其中有1個單等位基因突變的陽性單克隆細(xì)胞系，打靶效率為6.5‰;由脂質(zhì)體法介導(dǎo)打靶兩次，第一次獲得83個單克隆細(xì)胞系，其中有2個單等位基因突變的陽性單克隆細(xì)胞系，第二次獲得316個單克隆細(xì)胞系，其中有12個單