miR-144調(diào)節(jié)FLSs鈣粘附蛋白-11表達(dá)及在RA病理進(jìn)程中的作用.pdf

1、目的：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種主要以關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥為特點(diǎn)的全身性自身免疫反應(yīng)。該病可導(dǎo)致骨和軟骨的破壞和變性，關(guān)節(jié)發(fā)生畸形和強(qiáng)直。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全闡明，且病情常常遷延難愈，嚴(yán)重?fù)p害患者的生命健康。因此探討RA的發(fā)病因素及致病機(jī)制對于RA疾病的治療有重要的研究價值。本研究通過對關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中鈣粘附蛋白-11（Cadherin-11，可縮寫為Cad-11）的表達(dá)與

2、miR-144、RA的相關(guān)性進(jìn)行研究，以探討miR-144過表達(dá)慢病毒在RA小鼠滑膜組織病理進(jìn)程的作用及其病理機(jī)制。
　　方法：選擇BALB/c6-8周小鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量為（20±2）g，隨機(jī)選取將其隨機(jī)分為3組，即正常組、佐劑組和模型組，其中模型組為將Ⅱ型膠原乳劑注射至BALB/c小鼠尾根部皮下構(gòu)建由Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠模型。進(jìn)行各組膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病

3、理學(xué)比較。在細(xì)胞學(xué)層面上，進(jìn)行成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLSs)原代培養(yǎng)，并分組干預(yù)。分為空白對照小鼠(CT) FLSs組、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型(RA) FLSs組，RA+miR-144組及RA+Anti-miR-144組，qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測各組miR-144、Cadherin-11、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平，Western實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞中Cadherin-11的表達(dá)。進(jìn)而利用ELISA測量培養(yǎng)細(xì)胞上清中炎性因子的含量

4、，包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6等。在體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)部分，利用12只CIA模型小鼠，隨機(jī)分為3組，即鹽水組，空載組和miR-144組，其中miR-144組是以miR-144過表達(dá)慢病毒進(jìn)行尾靜脈注射處理。對模型小鼠滑膜組織進(jìn)行HRP標(biāo)記抗體法及免疫組化檢測Cadherin-11和TNF-α的表達(dá)和分布，并用HE染色檢測滑膜組織的病理變化特點(diǎn)。
　　結(jié)果：(1)用于檢測建模情況的3組小鼠分別經(jīng)未做特殊處理、佐劑乳劑處理和

5、Ⅱ型膠原處理處理后，其膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理切片在光鏡下觀察提示:正常組和佐劑組小鼠經(jīng)不同處理后，其膝關(guān)節(jié)的滑膜組織中細(xì)胞分布均勻且排列規(guī)則，局部無炎性細(xì)胞浸潤和血管翳形成，膝關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞排列規(guī)則、軟骨組織表面光滑。模型組小鼠膝關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)明顯，單核細(xì)胞大量增生，并有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤，有部分組織的水腫和滑膜層細(xì)胞增生和血管翳的形成，滑膜組織中出現(xiàn)細(xì)胞纖維化和纖維性滲出，并有膠原纖維的沉積，關(guān)節(jié)軟骨組織破壞嚴(yán)重。運(yùn)用實(shí)時定量

6、基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)測定CT組和RA組miR-144、Cadherin-11及炎性因子水平，結(jié)果顯示，RA組miR-144明顯低于CT組，Cad-11、TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯高于CT組(p＜0.05)，IL-2兩組未見統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　(2)細(xì)胞學(xué)體外檢測，在RA組及RA+miR-144組，其Cad-11水平無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，但均明顯高于CT組和RA+Anti-miR-144組(p＜0.

7、05)。RA+miR-144組其TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯低于RA組(p＜0.05)。四組IL-2水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。運(yùn)用Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果提示CT組和RA未轉(zhuǎn)染miR-144組可觀察到明顯的蛋白印跡，經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-144的RA小鼠成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中未看到明顯的蛋白印跡，而RA+Anti-miR-144組同樣可以看到明顯的蛋白印跡。定量提示RA組Cadherin-11水平明顯高于CT組

8、(p＜0.05)，而經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-144的RA小鼠FLSs中Cadherin-11水平明顯低于RA組與RA+Anti-miR-144組(p＜0.05)。ELISA結(jié)果提示RA+miR-144組其TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯低于RA組和RA+Anti-miR-144組(p＜0.05)，而RA組和RA+Anti-miR-144組其TNF-α、IL-1、IL-6無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。四組中的IL-2均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p

9、＞0.05)。
　　(3)在體實(shí)驗(yàn)部分，各組膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理切片在光鏡下觀察提示:鹽水組和空載組小鼠經(jīng)處理后，膝關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)明顯，炎性浸潤并有滑膜細(xì)胞增生和血管翳生成，軟骨組織受損。miR-144組小鼠膝關(guān)節(jié)的滑膜細(xì)胞均勻排列規(guī)則，局部無典型的炎癥反應(yīng)，軟骨組織未受破壞。免疫組化染色顯示:TNF-α散在分布于膝關(guān)節(jié)的滑膜層中。經(jīng)Image-Pro Plus6.0軟件分析，提示鹽水組、空載組、miRNA組TNF-α表達(dá)百分?jǐn)?shù)分

10、別為0.79±0.05、0.73±0.07、0.28±0.04;鹽水組與空載組的RA模型小鼠滑膜層中TNF-α的表達(dá)水平相接近，兩組間滑膜層TNF-α的表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.05); RA模型小鼠經(jīng)miR-144高表達(dá)慢病毒處理后，滑膜組織TNF-α表達(dá)水平明顯下降，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　miRNA高表達(dá)慢病毒處理后RA模型小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織在熒光顯微鏡下觀察提示:Cadherin-11蛋白均勻地分布于

11、膝關(guān)節(jié)的滑膜層細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與既往報道的FLSs的形態(tài)一致。結(jié)果經(jīng)Image-Pro Plus6.0軟件分析，提示鹽水組、空載組、miRNA組Cadherin-11表達(dá)百分?jǐn)?shù)分別為0.45±0.07、0.36±0.06、0.12±0.03，鹽水組和空載組經(jīng)生理鹽水與經(jīng)空載慢病毒液處理的RA模型小鼠滑膜層細(xì)胞中Cadherin-11蛋白表達(dá)水平相近，經(jīng)檢驗(yàn)，這兩組之間滑膜層細(xì)胞的Cadherin-11蛋白的表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.05

12、);但實(shí)驗(yàn)組小鼠注射mi-RNA高表達(dá)慢病毒后，滑膜層細(xì)胞的Cadherin-11蛋白表達(dá)水平較其他組明顯下降，經(jīng)檢驗(yàn)，注射miRNA高表達(dá)慢病毒小鼠與其他兩組小鼠之間滑膜層細(xì)胞Cadherin-11蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：機(jī)體中miRNA-144增加可減弱或抑制關(guān)節(jié)炎模型小鼠中滑膜組織的炎癥反應(yīng)，并下調(diào)其TNF-α的表達(dá)，且這一作用是miRNA-144抑制滑膜細(xì)胞中Cadherin-11的效應(yīng)。