miR-144靶向細(xì)胞周期蛋白B1抑制肝癌增殖、遷移和侵襲的初步研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，針對(duì)肝癌的靶向治療手段依然缺乏。本研究首先利用TCGA和GEO公共數(shù)據(jù)庫的大樣本肝癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1)表達(dá)水平呈異常升高，但是其異常表達(dá)的機(jī)制尚不明確。為了研究CCNB1在肝癌中異常高表達(dá)的分子機(jī)制，我們首先通過生物信息學(xué)手段篩選鑒定出能夠靶向抑制CCNB1的miR-144，并且我們通過RT-PCR、Westernblot證實(shí)在肝癌細(xì)胞中，miR-144能夠靶

2、向抑制CCNB1的表達(dá)。同時(shí)進(jìn)一步，我們利用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-144-CCNB1調(diào)節(jié)軸的體內(nèi)作用，為miR-144-CCNB1調(diào)節(jié)軸成為肝癌潛在靶向治療靶點(diǎn)提供更加充分的證據(jù)。研究結(jié)果表明:和轉(zhuǎn)染空病毒的裸鼠組相比，過表達(dá)miR-144后裸鼠皮下肝癌增殖速度明顯減慢，裸鼠生存時(shí)間明顯增加。同時(shí)經(jīng)過免疫組化證實(shí)過表達(dá)miR-144后CCNB1表達(dá)降低，Ki67降低，說明肝癌中miR-144能夠靶向負(fù)向調(diào)節(jié)CCNB1的

3、表達(dá)，繼而影響腫瘤增殖速度。
　　通過以上三部分的實(shí)驗(yàn)，我們得出以下結(jié)論:
　　1，CCNB1在肝癌中表達(dá)明顯升高，并和患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率等臨床惡性表型和臨床預(yù)后密切相關(guān)，CCNB1在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到促癌基因作用;
　　2，miR-144在肝癌中能夠特異性的結(jié)合CCNB1的3'UTR區(qū)，靶向調(diào)控CCNB1的表達(dá)。
　　3，miR-144在肝癌中表達(dá)明顯降低，同時(shí)miR-144低表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯短于m

4、iR-144的表達(dá)高的患者;過表達(dá)后，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，肝癌細(xì)胞系的增殖能力顯著降低，遷移能力和侵襲能力以及成瘤能力明顯降低，提示miR-144在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到抑癌基因作用，miR-144通過負(fù)性調(diào)節(jié)其靶基因CCNB1的蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌進(jìn)展。
　　4，miR-144/CCNB1調(diào)節(jié)軸在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，有可能成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。
　　第一部分 CCNB1在肝癌中的表達(dá)和臨床預(yù)后的分析及其在肝癌

5、中的生物學(xué)功能
　　目的:
　　研究CCNB1在肝癌組織中的表達(dá)和臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，探討CCNB1在肝癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)8對(duì)肝癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織CCNB1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況。
　　2.基于生物信息學(xué)技術(shù)，利用基因芯片分析軟件BRB-Arraytools進(jìn)行肝癌基因表達(dá)譜挖掘，下載并分析TCGA和GEO公共數(shù)據(jù)庫中的肝癌

6、基因芯片數(shù)據(jù)，分析CCNB1 mRNA在肝癌組織與正常肝癌中的表達(dá)情況。
　　3.利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫中的肝癌基因芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合其臨床隨訪數(shù)據(jù)，分析CCNB1 mRNA在肝癌組織中的表達(dá)和肝癌臨床表型之間的關(guān)系。
　　4.從mRNA和蛋白水平綜合分析CCNB1表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床特征及預(yù)后之間的聯(lián)系。
　　5.基于組織芯片技術(shù)檢測(cè)CCNB1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度，通過單因素和多因素COX回歸、以及生存分析等手段分析

7、CCNB1蛋白表達(dá)強(qiáng)度與肝癌患者臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　6.利用RNA干擾技術(shù)沉默CCNB1基因，將靶向CCNB1的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HepG2和7721，檢測(cè)研究其對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(MTT)、凋亡（流式AnnexinⅤ染色法）、遷移（劃痕實(shí)驗(yàn)）和侵襲(transwell)的生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果:
　　1.肝癌組織中的表達(dá):與正常肝組織對(duì)比，在mRNA(TCGA和GEO基因數(shù)據(jù)庫分析)和水平蛋白

8、（肝癌組織芯片），肝癌組織中CCNB1表達(dá)水平均有一定程度的上調(diào)(P＜0.05)。
　　2.根據(jù)CCNB1的表達(dá)水平，我們進(jìn)行了單因素分析，從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中我們可以看出，肝癌組織中CCNB1低表達(dá)占40％，高表達(dá)占60％，CCNB1的表達(dá)與TNM分期(P=0.038)、轉(zhuǎn)移(P=0.000)、復(fù)發(fā)(P=0.030)有關(guān)，而與性別(P=0.573)、年齡(P=0.461)、腫瘤直徑(P=0.057)、AFP(P=0.665)、HBs

9、Ag(P=0.897)無明顯相關(guān)。
　　3.其次我們根據(jù)患者的預(yù)后進(jìn)行了單因素分析，從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中我們可以看出，肝癌患者的預(yù)后與TNM分期(P=0.006)、轉(zhuǎn)移(P=0.000)、復(fù)發(fā)(P=0.041)以及CCNB1的表達(dá)有關(guān)(P=0.001)，而與性別(P=0.430)、年齡(P=0.086)、腫瘤直徑(P=0.118)、AFP(P=0.740)、HBsAg(P=0.897)無明顯相關(guān)。
　　4.根據(jù)肝癌組織芯片的分析

10、結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示CCNB1的表達(dá)水平與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，單因素分析結(jié)果顯示CCNB1的表達(dá)與肝癌臨床惡性表型（轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、TNM分期及預(yù)后）密切相關(guān)。
　　5.CCNB1基因敲減后肝癌細(xì)胞系的增殖能力明顯降低，細(xì)胞遷移能力和侵襲能力以及成瘤能力受到顯著的抑制;CCNB1基因敲減后肝癌細(xì)胞系的凋亡率明顯升高。
　　第二部分靶向CCNB1基因的miR144的篩選與鑒定及其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行

11、為的影響
　　目的:
　　利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)能夠靶向CCNB1基因的microRNA進(jìn)行篩選和鑒定，并且在體外驗(yàn)證此microRNA對(duì)肝癌生物學(xué)行為的影響
　　方法:
　　1.通過在線預(yù)測(cè)工具(Targetscan，miRwalk，miRanda)篩選出能夠靶向CCNB1的miRNAs的集合，然后利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的425例肝癌樣本的microRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，然后從中尋找出在肝癌和癌旁中表達(dá)存在顯著性差

12、異，且在肝癌中低表達(dá)的miRNAs，篩選出潛在的可能靶向CCNB1的miR-144。
　　2.在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-144后，檢測(cè)CCNB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。
　　3.利用熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)miR-144對(duì)CCNB1的負(fù)性靶向調(diào)控作用。
　　4.分析TCGA數(shù)據(jù)中microRNA芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合其隨訪數(shù)據(jù)，分析miR-144在肝癌組織中的表達(dá)和肝癌臨床表型之間的關(guān)系。
　　5.在肝癌

13、細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-144后，觀察肝癌細(xì)胞的增殖能力變化。
　　結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)分析結(jié)果提示CCNB1可能是miR-144的靶基因。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-144可以抑制含有CCNB1結(jié)合位點(diǎn)的螢光報(bào)告基因的活性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)或抑制miR-144對(duì)CCNB1表達(dá)水平有明顯影響。
　　2.miR-144的表達(dá)水平在肝癌組織中顯著降低(p＜0.0001)，并且Kaplan-Meier分析結(jié)

14、果顯示miR-144的表達(dá)水平和肝癌患者的臨床預(yù)后顯著相關(guān)(p=0.017)，miR-144低表達(dá)的肝癌患者的生存時(shí)間明顯差于于miR-144高表達(dá)的患者，提示miR-144的表達(dá)和肝癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。
　　3.miR-144過表達(dá)后，肝癌細(xì)胞系的增殖能力明顯下降，與CCNB1敲除有相似的效果。從而證實(shí)了miR-144通過轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控CCNB1參與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　第三部分 miR-144對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)

15、行為影響的裸鼠體內(nèi)研究
　　目的:
　　通過構(gòu)建miR-144穩(wěn)定過表達(dá)的肝癌細(xì)胞系，并皮下注射入裸鼠體內(nèi)成瘤，觀察miR-144對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響。
　　方法:
　　1.利用慢病毒技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)miR-144的肝癌7721細(xì)胞系。
　　2.構(gòu)建miR-144過表達(dá)慢病毒載體，將miR-144過表達(dá)載體感染肝癌細(xì)胞以上調(diào)miR-144表達(dá)，將這種過表達(dá)miR-144的肝癌細(xì)胞注入裸鼠皮下，在體內(nèi)觀察m

16、iR-144對(duì)肝癌生物學(xué)行為的影響。
　　3.觀察并記錄裸鼠生存時(shí)間，記錄腫瘤體積和重量變化，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)RT-PCR和Westernblot鑒定，過表達(dá)miR-144的肝癌7721細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，和轉(zhuǎn)染空病毒的裸鼠組相比，過表達(dá)miR-144后肝癌增殖速度明顯減慢，生存時(shí)間明顯增加。
　　3.免疫組化證實(shí)過表達(dá)miR-144后CCNB1表達(dá)降低，Ki

17、67降低。
　　全文結(jié)論：
　　1.CCNB1在肝癌中表達(dá)明顯升高，并和患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率等臨床惡性表型密切相關(guān)，同時(shí)CCNB1低表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯高于CCNB1的表達(dá)高的患者;下調(diào)CCNB1后，肝癌的增殖能力顯著下降，凋亡率明顯升高，遷移和侵襲能力以及成瘤能力明顯下降提示CCNB1在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到促癌基因作用。
　　2.過表達(dá)或抑制miR-144對(duì)CCNB1水平有明顯影響，提示miR-144在肝癌中能夠

18、靶向調(diào)控CCNB1的表達(dá)。
　　3.miR-144在肝癌中表達(dá)明顯降低，同時(shí)miR-144低表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯短于miR-144的表達(dá)高的患者;過表達(dá)后，肝癌在體內(nèi)外的增殖能力軍顯著下降，遷移和侵襲能力以及成瘤能力明顯下降。提示miR-144在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起到抑癌基因作用。
　　4.miR-144通過負(fù)性調(diào)節(jié)其靶基因CCNB1的蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌進(jìn)展，miR-144/CCNB1調(diào)節(jié)軸在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了