網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒LAMP檢測方法及感染性分子克隆的建立.pdf

1、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)是禽類一種重要的免疫抑制性和致瘤性疾病。近年來,國內(nèi)外雞群中REV流行逐漸嚴重。REV與馬立克氏病病毒(MDV)、雞貧血病毒(CAV)和J-亞群禽白血病病毒(ALV-J)幾種免疫抑制性病毒的混合感染在部分養(yǎng)雞場中普遍存在,使得雞群免疫力低下,導(dǎo)致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失敗,并容易造成繼發(fā)感染,使疫病的診斷和防控難度加大。另外,REV基因組易于整合到MDV和FPV基因組中,從而導(dǎo)致商品化疫苗受到污染。使用非

2、SPF禽胚制備的疫苗也有污染REV的潛在危險。近來,RE的危害正逐漸被人們關(guān)注,但RE的診斷、流行病學(xué)以及基礎(chǔ)研究仍不完善。為了更好地認識和防控RE,本文進行了如下方面的研究:
　　 1REVLAMP可視化快速檢測方法的建立
　　 借助新興的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMe),設(shè)計了4條針對REVpol基因的6個位點的特異性引物,建立了一套簡便、靈敏和特異的檢測方法。該方法不與常見的感染雞群的DNA病毒(MDV、CAV)及A

3、LV-J發(fā)生交叉反應(yīng),比常規(guī)的PCR方法靈敏25倍;另外,該LAMP方法在臨床樣品方面的檢測效率與傳統(tǒng)的PCR方法相當;而且操作簡單,不需要復(fù)雜的儀器,常規(guī)水浴鍋即可進行,肉眼可直接觀察檢測結(jié)果。
　　 2REVgp90蛋白的表達及多克隆抗體的制備
　　 利用PCR技術(shù),從病料中擴增REVgp90基因,將其分別克隆至真核表達載體pFastBacHTA和原核表達載體pET-28a(+)中,從而構(gòu)建了真核表達的供體質(zhì)粒pF-

4、gp90和原核表達質(zhì)粒pET28-gp90。pF-gp90轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭載體中,獲得重組穿梭載體Bacmidgp90。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞,獲得重組桿狀病毒rBacgp90。通過Westernblot和IFA驗證,rBacgp90可正確表達gp90蛋白,蛋白大小約為45kDa,變性和自然狀態(tài)下均能夠被識別,具有良好的生物活性。將pET28-gp90轉(zhuǎn)化至大腸桿菌

5、BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),進行g(shù)p90蛋白原核表達并通過Westernblot檢測,確定其以包涵體形式正確表達。純化gp90蛋白并免疫6-8周齡Balb/c小鼠,制備抗gp90的多克隆抗體。免疫小鼠后獲得的抗血清可與感染CEF細胞的REV發(fā)生特異性反應(yīng),ELISA效價達到1:12800。
　　 3RE流行病學(xué)研究
　　 對我國9個省35個蛋雞場進行了血清學(xué)調(diào)查,89％的雞場REV抗體陽性,陽性率為1％

6、-98％,平均陽性率為15％,說明REV在我國廣泛流行,部分地區(qū)較為嚴重。將研磨后無菌處理的病料接種于CEF或DF1,置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),7d后收毒,連續(xù)盲傳至少3代。做間接免疫熒光、PCR和電鏡檢測,確定是否分離到病毒。從東北地區(qū)的黑龍江、吉林、遼寧等省的一些雞場分離到10株REV。以HLJR0901為例,測得其TCID50為105.2/mL。通過繪制復(fù)制動力學(xué)曲線對其在CEF細胞上的增殖動態(tài)規(guī)律進行了研究,發(fā)現(xiàn)第六天和第七天R

7、EV增殖的滴度最高。將所分離的REV的主要保護性抗原基因-gp90基因,克隆至pMD-18T載體,測序并上傳GenBank。以前病毒cDNA為模板,將HLJR0901基因組分六段進行了克隆和測序。最后確定:HLJR0901全長8284bp,GenBank登錄號為GQ415646。
　　 序列分析結(jié)果顯示:HLJR0901的LTR序列與FA株完全同源;與APC-566的同源性也高達99％。Pol是最穩(wěn)定基因。LTR核營酸、gag氨

8、基酸、pol氨基酸、gp90氨基酸、env氨基酸以及全基因組核苷酸的遺傳進化樹顯現(xiàn)了一個共同的特征:①所比較的毒株明顯地分為三個分枝,分別代表REV的3個亞型;②東北分離株形成一個獨立的群體,與我國早期南方毒株HA9901(亞型Ⅰ)同源性較低,可能源于不同的祖先;③我國至少存在兩種REV亞型(Ⅰ型和Ⅲ型),Ⅲ型REV是目前東北地區(qū)的流行毒株。④東北分離株與目前美國和臺灣的一些流行毒株親緣關(guān)系較近。
　　 4REV感染性分子克隆的

9、建立及應(yīng)用
　　 通過重疊延伸PCR(SOEPCR)和酶切拼接將HLJR0901的全基因組克隆于pBluescriptⅡ載體中,并在基因組中通過改變核苷酸(C2250G)消除了其中的MscI酶切位點作為分子標簽,構(gòu)建了REV感染性分子克隆pBlu-mHLJR0901。將純化的pBlu-mHLJR0901轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(CEF)進行病毒拯救,經(jīng)間接免疫熒光(IFA)、PCR、測序及電鏡鑒定,成功拯救出REV。拯救病毒rHLJR

10、0901在CEF細胞上具有與親本毒相似的復(fù)制特性。基于感染性分子克隆,開展了表達EGFP的重組REV的構(gòu)建:在HLJR0901全基因組934位點(gag基因啟動子上游)和7713位點(env基因終止子下游)插入了EGFP基因,轉(zhuǎn)染CEF細胞后,前者EGFP能夠瞬時高效表達,后者不能表達。但最終均沒有拯救出重組病毒,其具體機制有待進一步探討。本研究還發(fā)現(xiàn),REVLTR的啟動子功能具有廣譜性,不僅在雞源細胞上能夠被識別,而且在哺乳細胞上也能

11、被識別。這些結(jié)果為REV的基礎(chǔ)研究提供了參考。
　　 5REV動物感染實驗
　　 將拯救的REV毒株rHLJR0901通過腹腔接種途徑感染1日齡SPF雛雞,進行REV的致病性研究。結(jié)果顯示:2周齡時REV能夠明顯影響雞的生長性能;REV對肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊等免疫相關(guān)器官均有一定程度的影響;感染后3w時血清開始陽轉(zhuǎn),但血清抗體陽性率一直是75％;整個實驗周期內(nèi)均可檢測到病毒血癥。動物感染實驗為REV病毒感染模型的建立