對蝦白斑綜合癥病毒LAMP-LFD檢測方法的建立.pdf

1、本研究建立了WSSV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的快速檢測方法(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)的檢測方法，并將該法與研制的FITC核酸檢測側(cè)向?qū)游鲈嚰?FITC nucleic acid detection lateral flow dipstick，F(xiàn)ITC-LFD)相結(jié)合建立了更為靈敏、特異、有效、更適合實(shí)地檢測的WSSV檢測方法LAMP-LFD。
　　 參照GenBank上發(fā)表的

2、WSSV基因組序列中的保守的囊膜蛋白基因VP28基因序列，設(shè)計兩條特異性的引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將產(chǎn)物與pDM-19T連接構(gòu)建重組載體pDMT-VP28；依照LAMP技術(shù)原理，利用Primer Explorer V4設(shè)計了四條引物利用構(gòu)建的VP28重組載體為標(biāo)準(zhǔn)模板，優(yōu)化建立了WSSV的LAMP檢測方法；而后對WSSV-DNA為模板進(jìn)行十倍系列稀釋，并以其為模板對LAMP與nested-PCR進(jìn)行了檢測限的比較。結(jié)果顯示，WSSV-

3、LAMP最佳反應(yīng)溫度為65℃、反應(yīng)時間為60min；LAMP對WSSV-DNA的最低檢測限為10拷貝、μL，而nested-PCR為100拷貝/μL，敏感性顯著顯著高于nested-PCR。
　　 利用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)與蛋白質(zhì)親和的作用，將其與BSA、OVA偶聯(lián)；以FITC-BSA免疫BALB/c小鼠，間接ELISA測定多抗血清效價，并對血清敏感性和特異性進(jìn)行鑒定以

4、確定細(xì)胞融合備用鼠。結(jié)果顯示：1號小鼠pAb效價最高，對FITC的半數(shù)抑制濃度最低，選擇用1號鼠進(jìn)行融合。利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備FITC單克隆抗體(Monoclonal antibody，mAb)，經(jīng)篩選得到6株高度敏感特異的雜交瘤細(xì)胞；以1B11體內(nèi)誘生腹水制備單克隆抗體，制備腹水效價為1/640000，半數(shù)抑制濃度IC50為7.812ng/mL，獲得了效價高、特異性強(qiáng)的FITC-mAb。
　　 檸檬酸三鈉還原法制備膠體金并將

5、其按3μL/條的量噴至玻璃纖維塑薄膜上；以0.5mg/mL的親和素和1 mg/mL的山羊抗鼠IgG按照1.2μL/cm得量分別標(biāo)記NC膜上的檢測線(T線)和控制線(C線)；組裝FITC核酸檢測側(cè)向?qū)游鲈嚰?FITC-LFD)。利用帶有生物素的引物FIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，在反應(yīng)完成前加入FITC的探針進(jìn)行雜交5min，終止反應(yīng)后以試紙檢測，建立WSSV-LAMP-LFD檢測方法；根據(jù)該試紙檢測不同條件下的擴(kuò)增產(chǎn)物得到的結(jié)果，優(yōu)化得到最適檢