禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒env基因蛋白抗原的表達及其檢測應用.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)引起的一種禽類重要的腫瘤性疾病，目前在我國的流行和危害越來越嚴重。該病直接導致禽死亡雖然并不常見，但感染禽表現(xiàn)生長遲緩、免疫抑制，降低疫苗接種的免疫應答而導致免疫失敗和降低雞體對疾病的抵抗力，導致禽群的淘汰率和死亡率升高，進而給養(yǎng)禽業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。為了建立ELISA等快速、特異、簡便的診斷技術，表達REV的囊膜糖蛋白env基因作為抗原并研制其相應的抗體是十分必要的，對

2、該病的防控具有重要的現(xiàn)實意義。 根據(jù)已發(fā)表的REV毒株鴨脾壞死病(SNV)的序列，設計并合成一對引物，以SNV前病毒cDNA全基因組克隆為模板，通過PCR技術，擴增出該病毒的囊膜糖蛋白env基因的整個開放閱讀框(ORF)；將PCR產(chǎn)物按正確的閱讀框架定向克隆進pGEX-6P-1載體中谷光甘肽-S-轉移酶(GST)的下游，將重組質粒轉化進宿主菌BL21中，在1.0 mmol/L IPTG的誘導下，env基因以融合蛋白的形式獲得了良

3、好的表達，表達產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，證實其表達的融合蛋白的大小為72kD；Western-Blot和ELISA檢測結果表明，純化的pGEX-6P-1-env重組融合蛋白抗原與REV標準陽性血清呈現(xiàn)良好的反應性。 將表達產(chǎn)物回收后免疫小鼠，所得的抗血清可與SNV感染的雞胚成纖維細胞(CEF)在免疫熒光試驗(FA)呈陽性反應。這表明，體外表達的重組融合蛋白具有很好的免疫原性，而且保留了天然蛋白所具有的抗原性。 以純化