禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病的快速診斷方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病(ReticuLoendotheliosis，RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(REV)引起的雞、火雞、鴨、鵪鶉、雉和鵝等以淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞增生為特征的腫瘤性疾病。盡管REV本身對(duì)禽的致死作用并不很明顯，但由于REV能使法氏囊萎縮，其致病基因V-rel能引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，侵損禽機(jī)體免疫系統(tǒng)，使機(jī)體抵抗力下降，從而導(dǎo)致其它疾病的并發(fā)感染，造成高淘汰率和高死亡率；血清學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)雞群感染REV的比率很高。建

2、立REV的檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。 研究一：通過(guò)制備純化的REV和雞抗REV的特異性血清，并在單抗118118的基礎(chǔ)上，初步建立了單抗捕捉的快速檢測(cè)REV抗體的ELISA診斷方法，對(duì)影響ELISA的各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，美國(guó)Coning公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板的變異系數(shù)為2.9％；單抗的最適包被濃度為1:1280；最適封閉液為1％的BSA，封閉條件為37℃1h；抗原的最佳稀釋度為l:320；血清的稀釋度為1:20；HRP-兔

3、抗雞IgG的工作濃度為1:15000，待檢血清和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為37℃1h；底物在室溫顯色時(shí)間為10min。根據(jù)已建立的ELISA反應(yīng)條件，確定陰陽(yáng)臨界值為0.253。用本方法與IDEXX公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒分別對(duì)200份血清進(jìn)行了檢測(cè)，兩者的符合率為87％。所建立的方法與雞新城疫、傳染性支氣管炎、馬立克氏病的陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。 研究二：用自行研制的ELISA試劑盒對(duì)15公司的43個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)約1674份血清進(jìn)行了血清

4、學(xué)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，養(yǎng)殖場(chǎng)的總陽(yáng)性率為93.1％，同一養(yǎng)殖場(chǎng)陽(yáng)性率也很高，從28％到100％。在進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查的同時(shí)，對(duì)某公司進(jìn)行了深入調(diào)查，結(jié)果表明，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病(RE)陽(yáng)性檢出率在85.71％～100％，其后代的陽(yáng)性檢出率在0％～44.83％。其中，部分雞群出現(xiàn)了一種以腺胃、肝臟、腎臟、脾臟等器官組織腫瘤樣變的傳染病，經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)、IDEXX公司試劑盒和自行研制的試劑盒進(jìn)行確診，證明為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(REV

5、)感染所致。 研究三：基于Light Cycler平臺(tái)，利用SYBR GreenI染料能特異與雙鏈DNA結(jié) 合而發(fā)熒光的特性，建立了一種熒光PCR方法檢測(cè)REV的方法。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程2h內(nèi)可以完成，以前病毒基因組DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，病毒的最低檢出濃度為10<'-6>，在特異性試驗(yàn)中，REV有特異性的擴(kuò)增曲線，而禽流感病毒和陰性對(duì)照一樣，沒(méi)有特異性擴(kuò)增。對(duì)REV患雞各器官組織進(jìn)行了熒光PCR檢測(cè)，各臟器病毒含量從高到低依次