機械牽張力對成骨樣細胞影響的糖蛋白組學的初步研究.pdf

1、機械力學刺激作為正畸牙周組織改建重要的生物調節(jié)因素在骨形成和骨重塑中發(fā)揮重要作用。正畸矯治錯合畸形的基本原理正是利用矯治器作用于牙齒，使得機械力通過牙體硬組織、牙周膜傳遞至牙槽骨，引起牙槽骨組織重塑，牙齒因此移動到新位置。適宜的機械刺激可通過影響成骨細胞的增殖活性、表型蛋白的表達和功能促進骨生長與骨重塑。糖蛋白組學方法為全面分析機械力學刺激對骨重塑翻譯后修飾、揭示參與骨形成和骨重塑的糖蛋白提供技術支持。為深入研究其機制，我們以糖蛋白組學

2、為技術平臺，通過篩選差異蛋白研究力學轉導中的重要蛋白質，為應力刺激下骨重塑機理的深入研究提供依據(jù)。
　　本實驗通過Flexcell應力加載系統(tǒng)，對人成骨樣細胞（MG-63）施以不同加載時間的周期性牽張力，采用凝集素芯片技術分析在不同加載時長情況下成骨樣細胞糖鏈變化，并對差異糖鏈的相關糖蛋白進行分離富集及質譜鑒定，明確應力刺激骨重塑中差異表達的糖蛋白，分析差異糖蛋白受應力刺激在骨重塑中的作用，為后續(xù)的研究提供依據(jù)：
　　1．機

3、械牽張力對成骨樣細胞糖蛋白糖鏈的影響
　　目的：研究機械牽張力對人成骨樣細胞MG-63糖蛋白糖鏈表達的影響。
　　方法：以Flexcell細胞應力培養(yǎng)系統(tǒng)對人成骨樣細胞MG-63施以形變率為12％，加載時長分別為4h、8h、12h、24h的周期性機械牽張力，利用凝集素芯片技術篩選出糖蛋白糖譜中差異表達的糖蛋白糖鏈，比較不同載荷時間對成骨樣細胞糖鏈的影響。
　　結果：8小時實驗組表達差異最明顯，在加力后實驗組凝集素Jac

4、alin、RCA120、LEL、GSL-I、DBA、VVA、ACA的親和作用增強，而對凝集素WFA、EEL、AAL、LCA、STL的親和作用減弱，提示在機械牽張力作用下成骨樣細胞表面可能出現(xiàn)增多的黏蛋白T/Tn抗原、I-抗原、N-乙酰半乳糖胺（包括α1-3鏈接方式）、α及β鏈接半乳糖結構，而巖藻糖α1-2鏈接半乳糖、核心巖藻糖、N-乙酰葡糖胺等結構減少。
　　結論：本文通過凝集素芯片技術研究發(fā)現(xiàn)力學刺激下成骨樣細胞糖鏈變化與時間呈

5、相關性，推測在加載4小時后成骨樣細胞便出現(xiàn)對信號轉導的重要調節(jié)修飾，在加載8小時后成骨樣細胞半乳糖型糖蛋白明顯增加，細胞已具備了某些骨化的早期表現(xiàn)。為研究骨改建信號轉導發(fā)生機制提供了糖組學理論支持。
　　2．不同應力成骨樣細胞的半乳糖型糖蛋白的分離純化
　　目的：利用以瓊脂糖微粒為固定載體的凝集素親和技術，對不同加載時長后的成骨樣細胞蛋白樣品進行糖蛋白的分離富集，為下一步質譜分析做準備。
　　方法：以結合榴蓮凝集素（J

6、acalin）及蓖麻凝集素（RCA120）的瓊脂糖微粒為載體對成骨樣細胞的空白組、8h和24h實驗組蛋白樣品進行半乳糖型糖蛋白的分離富集。在富集時固定化的凝集素與特定的糖蛋白結合，非結合部分則被洗脫。凝集素與之后洗脫液中的半乳糖競爭性結合，將糖結合物從固定化的凝集素上移除并收集。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證分離效果。
　　結果：SDS-PAGE電泳顯示瓊脂糖-凝集素親和層析技術可實現(xiàn)復雜蛋白質較好的分離。
　　結論：利用瓊脂糖

7、微粒做固定化載體，在富集糖蛋白過程中去除非糖蛋白和糖蛋白中的非半乳糖型糖蛋白，降低了樣品的復雜性，具有較好的有效性和特異性，為復雜樣品的蛋白糖基化研究提供基礎。
　　3．機械牽張力作用下成骨樣細胞差異糖蛋白的質譜分析
　　目的：用液相色譜質譜技術檢測不同機械牽張力條件下成骨樣細胞蛋白差異表達。根據(jù)鑒定結果推測成骨樣細胞的差異糖蛋白如何對機械牽張力刺激做出響應。
　　方法：將實驗二中富集后的糖蛋白樣品進行酶解脫鹽，之后使

8、用液相色譜（LC）分離蛋白質，LTQVelos?質譜儀進行多肽碎片的掃描鑒定并用BIOWORKS軟件搜索相應的數(shù)據(jù)庫。最后得到機械牽張力刺激骨重塑相關的差異糖蛋白。
　　結果：鑒定出24個差異表達糖蛋白，其中4個為空白組成骨樣細胞表達升高的糖蛋白，20個為實驗組表達升高的糖蛋白。差異表達的糖蛋白主要參與細胞增殖、細胞骨架、信號傳導及能量代謝等多個生命活動過程。
　　結論：力學刺激成骨樣細胞引發(fā)特征蛋白的功能改變，引起細胞增殖