赭曲霉毒素A誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的比較蛋白組學(xué)研究.pdf

1、目的:赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生的一種真菌毒素，其污染非常普遍，廣泛存在于小麥、玉米、豆類等糧食作物以及咖啡、葡萄酒、啤酒、面包等食品中。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OTA具有腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、致畸性、致突變性和致癌性等生物學(xué)效應(yīng)。1993年OTA被國(guó)際癌癥研究中心列為“可能的人類致癌物”。
　　河北省贊皇縣是我國(guó)胃癌高發(fā)區(qū)，胃癌年均死亡率超過(guò)59/10萬(wàn)。2006年

2、，我們對(duì)當(dāng)?shù)鼐用窦Z食中OTA的污染狀況進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鼐用袷秤玫男←溨蠴TA的平均含量為2.41μg/kg，明顯高于世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會(huì)(Joint FAO/WHO Expert Committee on FoodAdditives，JECFA)暫定的每周容許攝入量（100 ng/kg）。提示OTA的高污染可能與胃癌高發(fā)區(qū)居民胃癌的發(fā)生有關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)OTA急性暴露可以導(dǎo)致GES-1細(xì)胞氧化DNA損傷、細(xì)

3、胞周期阻滯以及損傷修復(fù)系統(tǒng)的破壞;而長(zhǎng)期暴露OTA可增強(qiáng)GES-1細(xì)胞的遷移力和侵襲性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，利用該轉(zhuǎn)化GES-1細(xì)胞株成功建立了裸鼠成瘤模型。但是，OTA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制目前并不清楚。
　　本研究利用惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞作為研究對(duì)象，篩選出OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵分子。我們首先采用雙向電泳技術(shù)分析GES-1細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程中蛋白質(zhì)譜的變化情況，篩選出可能與OTA

4、誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。然后，在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用蛋白印跡、Real-time PCR、免疫組織化學(xué)方法，進(jìn)一步驗(yàn)證雙向電泳篩選出的差異蛋白在OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。尋找OTA長(zhǎng)期暴露致人胃黏膜上皮細(xì)胞損傷乃至癌變過(guò)程中的關(guān)鍵事件，豐富和加深了人們對(duì)OTA生物效應(yīng)的認(rèn)識(shí)，為揭示胃癌高發(fā)區(qū)居民胃癌發(fā)生機(jī)制開(kāi)拓新的研究領(lǐng)域。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)與處理
　　正常

5、人胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)常規(guī)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清、100U/ml鏈霉素、100U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)分為OTA處理組和對(duì)照組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×104個(gè)/L，接種于培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)24h后，給予2.5μmol/L OTA處理72h，一周一次，染毒直至40代后收集細(xì)胞進(jìn)行惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。前期研究利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)OT

6、A長(zhǎng)期處理GES-1細(xì)胞后，使GES-1細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。
　　2、雙向電泳分析技術(shù)
　　提取發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞的蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳分析，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色顯示凝膠中的蛋白點(diǎn)。計(jì)算機(jī)比對(duì)掃描后，采用ImageMaster6.0圖像分析軟件對(duì)選定的凝膠進(jìn)行分析。然后，將篩選出的差異蛋白點(diǎn)從凝膠中的切出，通過(guò)膠內(nèi)胰蛋白酶解和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorpt

7、ion/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)獲得肽質(zhì)量指紋譜。最后對(duì)質(zhì)譜分析出的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。
　　3、蛋白免疫印跡(Western Blotting)
　　提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白印跡方法，檢測(cè)OTA誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞中雙向電泳技術(shù)篩選出的差異蛋白(CAPZA1、Annexin A3、GOLPH3L和TRX)的表達(dá)情況。
　　4、

8、Real-time PCR
　　提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成DNA后，利用Real time PCR方法檢測(cè)OTA處理后CAPZA1、Annexin A3、GOLPH3L和TRX的mRNA水平。
　　5、免疫組織化學(xué)法
　　將發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞接種裸鼠，于接種后16周將瘤組織取出，并固定，常規(guī)石蠟切片，然后利用免疫組織化學(xué)方法觀察Annexin A3在接種瘤組織中的表達(dá)情況。
　　6、統(tǒng)計(jì)
　　采用SPS

9、S19.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析與單因素方差分析(analysis ofvariance，ANOVA)，數(shù)據(jù)用(x)±s表示，檢驗(yàn)以P＜0.05為差異有顯著性意義
　　結(jié)果:
　　1、篩選與OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的差異表達(dá)蛋白
　　在可溶差異蛋白中，惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞與其平行對(duì)照細(xì)胞間共有58個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中有14個(gè)蛋白點(diǎn)變化最明顯，包括表達(dá)上調(diào)的9個(gè)蛋白點(diǎn)和表達(dá)下調(diào)的5個(gè)蛋白點(diǎn)。然后利用MAL

10、DI-TOF-MS技術(shù)對(duì)變化最明顯的4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，成功鑒定出4種差異表達(dá)蛋白，它們分別是CAPZA1、Annexin A3、GOLPH3L和TRX。其中Annexin A3和GOLPH3L在惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞中表達(dá)均明顯上調(diào)，而CAPZA1和TRX的表達(dá)明顯下調(diào)。這四種蛋白與細(xì)胞骨架構(gòu)象、細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能密切相關(guān)。
　　2、對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定
　　蛋白印跡及Real-time PC

11、R檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)2D電泳篩選出出的4種差異蛋白中Annexin A3和GOLPH3L在惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞中表達(dá)較正常對(duì)照組明顯上調(diào)(P＜0.05)，而CAPZA1和TRX在惡性轉(zhuǎn)化的GES-1細(xì)胞中的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯下調(diào)(P＜0.05)。其中以Annexin A3變化最為顯著。
　　3、Annexin A3在裸鼠接種瘤中的表達(dá)情況
　　在裸鼠成瘤標(biāo)本中Annexin A3的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P

12、＜0.05)。結(jié)果提示Annexin A3蛋白在OTA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中具有重要的作用。
　　結(jié)論:
　　1、通過(guò)蛋白組學(xué)技術(shù)，篩選出赭曲霉毒素A誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白:Annexin A3、CAPZA1、GOLPH3L和TRX。
　　2、Annexin A3和GOLPH3L的高表達(dá)可能參與介導(dǎo)了赭曲霉毒素A誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　3、CAPZA1和TRX的低表達(dá)可