生理劑量睪酮延緩雄性小鼠心肌細(xì)胞衰老-非雄激素受體介導(dǎo)的途徑.pdf

1、人口老齡化是上個(gè)世紀(jì)末到本世紀(jì)初出現(xiàn)的一個(gè)世界性問題。目前世界老齡人口,即60歲及以上的人口達(dá)6.5億。到2050年,預(yù)計(jì)老齡化人口將達(dá)到20億,且80％的老年人將生活在發(fā)展中國家。我國到2010年,60歲以上老年人口已有1.74億,占全國總?cè)丝诘?2.78％;預(yù)計(jì)到2015年和2020年,這一比例將分別達(dá)到15％和18％。因此倡導(dǎo)健康老齡化,促進(jìn)老齡人口的健康是衛(wèi)生提供者和社會(huì)的使命。理論上抗衰老治療可以改變衰老引起的生化和分子學(xué)方面

2、的變化,糾正衰老相關(guān)的生理學(xué)變化,減少對(duì)衰老相關(guān)疾病的易感性。美國抗衰老醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(A4M)聲稱:“衰老相關(guān)的能力喪失由機(jī)體的生理功能障礙引起,許多情況下這些功能障礙可被內(nèi)科治療所改善。人類的壽命可望延長,老年人的生活質(zhì)量可望改善”。
　　 我國與發(fā)達(dá)國家的心力衰竭患者數(shù)量都在不斷增加,發(fā)病率和患病率也在逐步上升,其重要原因之一就是社會(huì)人口老齡化,隨著年齡的增長心力衰竭患病率升高。歐洲心臟病學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),在普通人群中心力衰竭的總患

3、病率約為2％-3％,而在70-80歲的老年人群中,則高達(dá)10％-20％。以往一直認(rèn)為年齡屬于不可改變的因素,因而研究相對(duì)較少。但對(duì)傳統(tǒng)心力衰竭危險(xiǎn)因素的分析不能完全解釋其發(fā)生易感性和進(jìn)展速度易變性的特點(diǎn)。隨著年齡的增長,心力衰竭的易感性和進(jìn)展速度均增加,其原因是心臟隨增齡發(fā)生了衰老變化。故年齡是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素之一。因此,在日益人口老齡化的今天,研究心臟衰老可能對(duì)心力衰竭的防治具有重要的臨床意義。
　　 機(jī)體內(nèi)環(huán)

4、境失衡可引起細(xì)胞生存和器官功能障礙,加速衰老進(jìn)程。在增齡性變化的機(jī)制中也涉及到了性激素平衡的改變。睪酮是男性體內(nèi)最重要的雄激素,調(diào)節(jié)著靶器官的生長發(fā)育與衰老過程。睪酮可通過與靶組織細(xì)胞內(nèi)特異性雄激素受體(Aaadrogen receptor,AR)結(jié)合而發(fā)揮其生理作用。另外也可通過芳香化酶轉(zhuǎn)化為雌二醇而與雌激素受體(Estrogen receptor,ER)結(jié)合,產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。心臟是雄激素作用的靶器官,睪酮可通過與心肌細(xì)胞內(nèi)AR或ER

5、結(jié)合對(duì)心臟起直接調(diào)節(jié)作用。男性50歲后體內(nèi)總睪酮及生物活性睪酮水平顯著降低,與此同時(shí)雄激素靶器官的結(jié)構(gòu)和功能隨之發(fā)生顯著變化。老年男性血清睪酮水平與多種增齡相關(guān)性疾病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。與衰老相關(guān)的許多癥狀和體征,如性功能障礙、內(nèi)臟性肥胖、骨骼和肌肉強(qiáng)度減弱及情緒障礙等均與雄激素缺乏的年輕男性患者相似。睪酮可促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖,同時(shí)具有抗凋亡、抗炎癥前細(xì)胞因子及抑制氧化應(yīng)激等作用。已有研究發(fā)現(xiàn)睪酮缺乏與衰老相關(guān)的心血管疾病危險(xiǎn)因素和部分心血

6、管疾病相關(guān),如:代謝綜合征、胰島素抵抗、2型糖尿病、冠心病及心力衰竭等。這些結(jié)果提示雄激素缺乏與男性個(gè)體衰老之間可能存在著內(nèi)在的聯(lián)系。Palm Springs預(yù)期壽命協(xié)會(huì)聲稱:“通過補(bǔ)充體內(nèi)激素至年輕人水平有助于避免衰老相關(guān)的疾病,逆轉(zhuǎn)生物學(xué)年齡,延長預(yù)期壽命及有效改善生活質(zhì)量”。睪酮替代治療雄激素缺乏患者已被普遍接受,睪酮治療可改善老年及去勢(shì)C57BL/6鼠的腦衰老(認(rèn)知功能)。睪酮治療已作為治療心力衰竭的可選擇措施之一,可使心室肌細(xì)

7、胞的最大收縮峰值增加,還能增加心肌細(xì)胞的舒張速率。但睪酮替代治療糾正心力衰竭是否通過延緩心臟衰老本身,尚未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。那么,雄激素缺乏能否引起心臟衰老?睪酮替代治療能否延緩心臟衰老?對(duì)這些方面的研究可能為改善或延緩心力衰竭的發(fā)生提供重要的思路。
　　 心臟衰老是心臟隨增齡發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能異常的變化。心臟衰老的結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)為心室重量減少和左室壁厚度增加；心肌內(nèi)膠原數(shù)量增加,其物理特性也發(fā)生改變,致僵硬度增加。心臟衰老的功能異

8、常表現(xiàn)可總結(jié)為心臟儲(chǔ)備能力降低以及對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)力下降。具體表現(xiàn)為左室收縮和舒張功能隨增齡而下降,而以舒張功能下降為主,左室舒張?jiān)缙诔溆?0歲時(shí)平均下降50％；最大心率下降,從20歲到85歲最大心率減少約30％；心輸出量峰值下降,心指數(shù)儲(chǔ)備下降；對(duì)兒茶酚胺的反應(yīng)性降低,對(duì)腎上腺素能受體刺激的反應(yīng)降低,對(duì)壓力感受器和化學(xué)感受器的反應(yīng)性下降等。這些都是被廣泛報(bào)道的衰老引起的心臟損害。這些變化改變了心臟疾病發(fā)生的閾值、嚴(yán)重程度和預(yù)后。作為心臟

9、功能和收縮單元核心組成的心肌細(xì)胞,也是心臟衰老研究的核心。心肌細(xì)胞衰老時(shí)細(xì)胞總體數(shù)量持續(xù)減少,剩余細(xì)胞代償性肥大,肌漿網(wǎng)鈣泵ATP酶活性下降,收縮蛋白表達(dá)量及類型發(fā)生改變,細(xì)胞內(nèi)氧化酶及抗氧化酶活性發(fā)生改變等,這一系列的變化被認(rèn)為可導(dǎo)致心臟功能下降及心臟疾病發(fā)生增加。因此,干預(yù)心肌細(xì)胞的衰老可能改善心臟功能、延緩心臟疾病發(fā)生和發(fā)展。
　　 對(duì)心肌細(xì)胞衰老的研究也是圍繞衰老機(jī)制展開的。目前有關(guān)衰老機(jī)制的學(xué)說有數(shù)十多種,總體來說最終

10、歸結(jié)為兩大類型:一類是以自由基、糖基化、激素紊亂等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論,認(rèn)為衰老是環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行性和累積性毀壞的結(jié)果；另一類是以端?？s短、衰老基因、細(xì)胞周期調(diào)控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論,認(rèn)為衰老是機(jī)體有序的基因活動(dòng),是通過遺傳按程序預(yù)先安排好的,或?yàn)樘禺惖摹八ダ稀被蛩磉_(dá),或?yàn)榭捎没虻淖罱K耗竭。這兩大類理論從不同角度闡述了機(jī)體衰老的可能機(jī)制,使衰老的研究不斷向細(xì)胞、分子和基因水平深入。由于衰老是一個(gè)復(fù)雜的過程

11、,環(huán)境與遺傳因素都影響著衰老的過程,因此當(dāng)今有關(guān)衰老的研究已經(jīng)逐步走進(jìn)了將這兩種理論進(jìn)行合作的時(shí)代,并將發(fā)掘衰老的機(jī)制和延緩衰老的努力集中在一個(gè)相對(duì)明確的范圍之內(nèi),即集中在環(huán)境因子傷害造成的增齡性衰老改變的相關(guān)范圍之內(nèi)。引起心肌細(xì)胞衰老的原因也可歸納為以上2個(gè)方面的損傷因素,即外源性因素和內(nèi)源性因素。外源性因素或環(huán)境因素可影響內(nèi)源性因素,共同作用最終決定心肌細(xì)胞衰老發(fā)生的步伐。
　　 基于上述這些觀點(diǎn),我們假設(shè)雄激素缺乏這一外源

12、性環(huán)境因素可引起心肌細(xì)胞衰老,睪酮替代治療可延緩衰老的發(fā)生；而雄激素缺乏與睪酮治療對(duì)心肌細(xì)胞衰老的影響也是通過衰老機(jī)制中的外源性及內(nèi)源性途徑共同作用的結(jié)果。本研究用去勢(shì)雄鼠和睪丸女性化(Testicular feminized,Tfm)小鼠作為雄激素缺乏模型。Tfm小鼠呈現(xiàn)AR編碼基因的X染色體連鎖的單堿基對(duì)缺失。這一缺失引起AR mRNA移碼突變,導(dǎo)致AR提前終止。故Tfm鼠表現(xiàn)為無功能的AR,同時(shí)先天的睪酮缺乏(僅為同窩對(duì)照鼠的1/

13、10)。Tfm鼠可作為研究雄激素缺乏和外源性睪酮作用途徑的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。因?本研究圍繞以下兩個(gè)方面進(jìn)行,不但可以回答上述提出的假設(shè)問題,同時(shí)由于Tfm鼠表達(dá)無功能的AR,可以探討睪酮對(duì)心肌細(xì)胞的作用是否通過其經(jīng)典的AR途徑。
　　 一、雄激素缺乏誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞衰老及生理劑量睪酮(Testosteronepropionate,T)的干預(yù)作用
　　 本研究以目前公認(rèn)的衰老標(biāo)志物:衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(Age-assoc

14、iatedβ-galactosidase,SAβ—gal)活性和細(xì)胞的相對(duì)端粒長度為主要觀察指標(biāo),首先對(duì)雄激素缺乏誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老的可能性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀察。β-半乳糖苷酶活性采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法,心肌細(xì)胞相對(duì)端粒長度采用Real-time定量PCR法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)分4組:正常組(24周齡C57BL/6J雄鼠,n=8),去勢(shì)組(8周齡C57BL/6J雄鼠去勢(shì)后正常飼養(yǎng)到24周,n=8),Tfm組(24周齡Tfm小鼠,n=7),去勢(shì)+T組(8

15、周齡C57BL/6J雄鼠去勢(shì)后正常飼養(yǎng)4周,肌肉注射3.13mg/kg/72h丙酸睪酮3個(gè)月,n=8)。取左心室心肌組織分離心肌細(xì)胞后,測(cè)定上述指標(biāo)。結(jié)果顯示:與正常組相比,去勢(shì)組和Tfm組心肌細(xì)胞SAβ-gal藍(lán)染陽性面積平均光密度(Integrated optical density,IOD)值均明顯增加(P=0.000和P=0.000),而兩組藍(lán)染陽性面積IOD值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.108)；去勢(shì)組和Tfm組心肌細(xì)胞相對(duì)端粒

16、長度均明顯縮短(P=0.000和P=0.000),而兩組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.366)。這提示雄激素缺乏小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生了衰老。
　　 此外,睪酮干預(yù)對(duì)心肌細(xì)胞衰老研究的結(jié)果顯示:與去勢(shì)組相比,給予生理劑量睪酮治療使心肌細(xì)胞SAβ-gal藍(lán)染陽性面積IOD值明顯降低(P=0.000),相對(duì)端粒長度明顯延長(P=0.002)。提示生理劑量睪酮治療可延緩心肌細(xì)胞衰老的發(fā)生。
　　 二、雄激素缺乏小鼠心肌細(xì)胞衰老及生理劑量

17、睪酮(T)干預(yù)的機(jī)制
　　 為了進(jìn)一步探討雄激素缺乏及生理劑量睪酮對(duì)心肌細(xì)胞衰老影響的途徑及作用機(jī)制,我們觀察了生理劑量睪酮治療與未治療的小鼠心肌細(xì)胞各衰老相關(guān)指標(biāo)的變化,及AR缺乏對(duì)睪酮治療的影響。實(shí)驗(yàn)分5組:正常組(24周齡C57BL/6J雄鼠,n=8),去勢(shì)組(8周齡C57BL/6J雄鼠去勢(shì)后正常飼養(yǎng)到24周,n=8),Tfm組(24周齡Tfm小鼠,n=7),去勢(shì)+T組(8周齡C57BL/6J雄鼠去勢(shì)后正常飼養(yǎng)4周,肌肉注

18、射3.13mg/kg/72h丙酸睪酮3個(gè)月,n=8),Tfm+T組(12周齡Tfm小鼠肌肉注射3.13mg/kg/72h丙酸睪酮3個(gè)月,n=8)。取左心室心肌組織分離心肌細(xì)胞后,比色法測(cè)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,巢式PCR法測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體DNA突變率,Real-time定量PCR法測(cè)定心肌細(xì)胞相對(duì)端粒長度,Western-blot法檢

19、測(cè)心肌細(xì)胞周期調(diào)控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:(1)與正常組相比,去勢(shì)組和Tfm組SOD活性下降(P=0.011和P=0.028)；MDA含量升高(P=0.001和P=0.000)；線粒體DNA突變率增高(P=0.000和P=0.000)；相對(duì)端粒長度縮短(P=0.000和P=0.000)；周期調(diào)控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達(dá)量均顯著升高(p16INK4a:P=0.035和P=0.

20、005；Rb:P=0.000和P=0.000；p53:P=0.000和P=0.000)。而兩實(shí)驗(yàn)組上述指標(biāo)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)與去勢(shì)組相比,去勢(shì)+T組SOD活性增高(P=0.000)；MDA含量降低(P=0.000)；線粒體DNA突變率減低(P=0.008)；相對(duì)端粒長度延長(P=0.001)；周期調(diào)控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達(dá)量均下調(diào)(p16INK4a:P=0.024；Rb:P=0.000；p53:P=0.

21、000)。(3)與Tfm組相比,Tfm+T組SOD活性增高(P=0.038)；MDA含量降低(P=0.001)；線粒體DNA突變率減低(P=0.000)；相對(duì)端粒長度延長(P=0.000)；周期調(diào)控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達(dá)量均下調(diào)(p16INK4a:P=0.002；Rb:P=0.000;p53:P=0.000)。(4)去勢(shì)+T組與Tfm+T組相比,上述各指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于Tfm鼠表達(dá)無功能的AR,通過對(duì)其

22、與去勢(shì)小鼠睪酮治療后衰老相關(guān)指標(biāo)的比較,提示生理劑量睪酮通過非經(jīng)典AR依賴的機(jī)制延緩心肌細(xì)胞衰老。
　　 結(jié)論:
　　 通過本研究,我們能夠得出以下結(jié)論:
　　 1.雄激素缺乏小鼠(去勢(shì)和Tfm小鼠)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)衰老的細(xì)胞特征,提示雄激素缺乏可引起心肌細(xì)胞衰老。雄激素缺乏可通過增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激,增加線粒體DNA突變率,縮短相對(duì)端粒長度和上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子p16INK4a、去磷酸化Rb及p53蛋白的表達(dá)等途徑