Pax8基因在調(diào)節(jié)小鼠心肌細(xì)胞生長(zhǎng)與衰老中的作用研究.pdf

1、研究背景:先天性心臟病是全球性的健康問(wèn)題，在兒童中的發(fā)病率很高，其最常見(jiàn)的類(lèi)型包括房間隔缺損，室間隔缺損和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉。盡管醫(yī)學(xué)研究和技術(shù)在不斷進(jìn)步和更新，先天性心臟病潛在的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚。大約40％胚胎期死亡是由于先天性心臟發(fā)育異常引起的。心臟的發(fā)育是由基因和環(huán)境兩個(gè)因素共同調(diào)控的，基因?qū)π呐K發(fā)育的調(diào)控是復(fù)雜的，是多種基因和通路參與調(diào)控的綜合結(jié)果。在哺乳動(dòng)物的發(fā)育生物上，心臟是最早形成的有功能的器官。在小鼠胚胎的第7.5天，心臟就

2、開(kāi)始發(fā)育了。最早參與心臟發(fā)育調(diào)控的基因是Nkx2.5，之后，GATA, bHLH，Irx家族共同參與心臟發(fā)育的調(diào)控，參與調(diào)控的信號(hào)途徑主要有BMP，Wnt，Notch信號(hào)途徑等。BMP屬于TGF-β超家族，目前認(rèn)為，至少存在6種在心臟特異表達(dá)的BMPs形式。BMP被認(rèn)為在細(xì)胞凋亡、分化、增殖和形態(tài)發(fā)生中起重要作用。心臟特異性敲除ALK3的小鼠死于胚胎發(fā)育中期，伴有心臟發(fā)育異常，病理檢查發(fā)現(xiàn)存在室間隔缺損，心臟內(nèi)膜墊形成障礙，以及肌小梁發(fā)

3、育異常。
　　我們實(shí)驗(yàn)室基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)，Pax8基因可能是ALK3基因的下游基因。Pax8屬于成對(duì)盒基因家族，在進(jìn)化上屬于高度保守的序列。Pax8的表達(dá)有時(shí)空特異性，在終末分化的細(xì)胞中表達(dá)較少，但并不絕對(duì)，在甲狀腺，胸腺，胰腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等細(xì)胞中例外，在特殊的疾病如腫瘤的刺激下，Pax8蛋白表達(dá)也會(huì)升高，所以Pax8被認(rèn)為是通過(guò)抑制終末分化和凋亡來(lái)調(diào)節(jié)組織生理病理功能的一種分子。
　　此前，Pax8在心臟方面的作用很少有

4、人研究，我們認(rèn)為，Pax8可能在調(diào)節(jié)室間隔發(fā)育中有著重要的作用。通過(guò)系統(tǒng)性Pax8基因敲除小鼠心臟形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Pax8-/-純合子小鼠心臟比普通小鼠心臟小，呈球形，左室壁肥厚，左室乳頭肌肥大，并伴有室間隔缺損，心功能檢查中，超聲心動(dòng)圖示舒張功能下降，電鏡檢查提示凋亡的心肌細(xì)胞增加，線粒體數(shù)量增加，但體積變小了。為了進(jìn)一步探索Pax8與心臟發(fā)育的機(jī)制研究，我設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。在心臟發(fā)育的潛在機(jī)制中，凋亡與增殖的調(diào)節(jié)失衡可能導(dǎo)致間隔發(fā)育異

5、常。最新的研究表明，細(xì)胞衰老可能參與胚胎的發(fā)育。細(xì)胞衰老分為生理性的衰老和病理性的衰老，生理性的衰老主要參與有害細(xì)胞清除的機(jī)制和生物體發(fā)育，病理性衰老可以由多種危險(xiǎn)因素觸發(fā)，如DNA損傷，線粒體代謝異常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和端?？s短等。我們認(rèn)為，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老可能共同參于Pax8基因敲除小鼠的心臟形成。
　　研究目的:1.驗(yàn)證ALK3/Pax8通路在細(xì)胞凋亡中的作用;
　　2.探索細(xì)胞衰老是否參與了系統(tǒng)性Pax8基因敲除小鼠的心

6、臟發(fā)育;
　　3.構(gòu)建心臟條件性Pax8敲除的小鼠模型，進(jìn)一步驗(yàn)證Pax8在心臟發(fā)育方面的作用。
　　方法:第一部分:構(gòu)建Pax8真核表達(dá)載體和ALK3 shRNA載體，在H9C2心肌細(xì)胞株中，使ALK3低表達(dá)和Pax8高表達(dá)，Western blot觀察Caspase依賴(lài)的凋亡通路，形態(tài)學(xué)上進(jìn)行DAPI染色觀察凋亡情況。CCK-8法檢測(cè)Pax8在增殖方面的作用。在小鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，慢病毒包裝載體轉(zhuǎn)染高表達(dá)Pax8基

7、因，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行AnnexinⅤ FITC/PI雙染檢測(cè)觀察能否緩解血清饑餓誘導(dǎo)的凋亡。第二部分:分別收集系統(tǒng)性敲除的Pax8-/-純合子，Pax8+/-雜合子和野生型小鼠，并建立時(shí)間梯度，收集胚胎期第18天(E18)，出生后第7天(P7)和出生后第14天(P14)小鼠心臟。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)組織中衰老相關(guān)指標(biāo)mRNA:周期蛋白激酶抑制劑（如p21，p53，p16，p19），線粒體代謝相關(guān)指標(biāo)(PGC-1α，Cytc)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

8、應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)(XBP1，Erp72a)。Westren blot檢測(cè)衰老相關(guān)周期蛋白激酶抑制劑及衰老相關(guān)異染色質(zhì)(HP1γ)蛋白水平。細(xì)胞衰老相關(guān)的半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色作為衰老標(biāo)志替代染色。免疫組化和免疫熒光法在心臟組織切片上檢測(cè)周期蛋白激酶抑制劑和HP1γ。體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞株中檢測(cè)衰老相關(guān)指標(biāo)的mRNA水平，初步觀察ALK3/Pax8通路與細(xì)胞衰老的關(guān)系。第三部分，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建P

9、ax8基因sgRNA/Cas9載體，體外轉(zhuǎn)錄后與Cas9 mRNA共同注射小鼠受精卵原核，構(gòu)建Pax8 flox/flox小鼠。
　　結(jié)果:第一部分:在H9C2心肌細(xì)胞株中，Pax8高表達(dá)部分挽救了ALK3沉默引起的細(xì)胞凋亡增加，并促進(jìn)心肌細(xì)胞株增殖。在小鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，進(jìn)一步驗(yàn)證了Pax8緩解細(xì)胞凋亡的作用。第二部分:相對(duì)于野生型小鼠，衰老細(xì)胞和衰老相關(guān)標(biāo)志物在系統(tǒng)性敲除的Pax8-/-小鼠中更明顯，這種趨勢(shì)在年長(zhǎng)的小鼠