炎癥狀態(tài)下Neuropilin-1+誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能和穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的:
　　本課題研究Nrp-1和Helios在tTreg，pTreg和iTreg細(xì)胞表達(dá)的差異，通過體內(nèi)體外實驗觀察Nrp-1+iTreg細(xì)胞的功能和穩(wěn)定性，尤其在炎癥狀態(tài)下Nrp-1+iTreg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用和穩(wěn)定性，并探討其發(fā)揮免疫抑制作用和維持免疫穩(wěn)態(tài)的機制。
　　方法:
　　1.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)法檢測B6 Foxp3GFP小鼠脾臟CD4、CD8、CD19、CD11c、NK1.1、CD11b陽性細(xì)胞Nr

2、p-1和Helios的表達(dá)水平。以及檢測小鼠胸腺、淋巴結(jié)、脾臟和外周血細(xì)胞CD4+Foxp3+T細(xì)胞和CD4+Foxp3-T細(xì)胞Nrp-1和Helios的表達(dá)水平。
　　2.構(gòu)建骨髓移植模型，F(xiàn)CM法檢測移植8周后淋巴結(jié)、脾臟和外周血CD4+Foxp3+T細(xì)胞和CD4+Foxp3-T細(xì)胞Nrp-1和Helios的表達(dá)水平。
　　3.在不同條件下體外培養(yǎng)獲得Th0、Th1、Th2、Th17、CD4medT和iTreg細(xì)胞，檢測

3、各自Nrp-1和Helios的表達(dá)水平。
　　4.IL-2和TGF-β條件下體外培養(yǎng)iTreg細(xì)胞，檢測第0、2、3、7和13天Nrp-1和Helios的表達(dá)水平。
　　5.體外誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞，加入Smad3抑制劑(SIS3)、JNK抑制劑(JNKi)或Ⅰ型TGF-β受體(ALK5)抑制劑(ALK5i)或DMSO對照，比較不同抑制劑對iTreg細(xì)胞Nrp-1和Helios表達(dá)的影響。
　　6.體外分選出Nrp-1+

4、iTreg和Nrp-1-iTreg細(xì)胞，體外直接培養(yǎng)后第4和7天檢測Foxp3GFP、IFN-γ和IL-17A表達(dá)水平;或經(jīng)尾靜脈輸注到B6Rag1-/-小鼠，第4、7和12天后檢測Foxp3GFP、IFN-γ和IL-17A表達(dá)水平。
　　7.Nrp-1+iTreg、Nrp-1-iTreg和Nrp-1Toxp3-CD4+T細(xì)胞抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的差異比較。
　　8.采用B6 Rag1-/-小鼠，腹腔注射CD4+

5、CD25-CD45RBhi T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)腸炎模型。分為5組，CD4+CD25-CD45RBhiT細(xì)胞，CD4+CD25-CD45RBhi T細(xì)胞+Nrp-1+iTreg， CD4+CD25-CD45RBhiT細(xì)胞+Nrp-1-iTreg細(xì)胞，CD4+CD25-CD45RBhiT細(xì)胞+Nrp-1+Foxp3-CD4+T，CD4+CD25-CD45RBhiT細(xì)胞+Nrp-1-Foxp3-CD4+T，觀察小鼠體重變化、腸道病理，腸系

6、膜淋巴結(jié)細(xì)胞IFN-γ，IL-17A和Foxp3表達(dá)水平。
　　9.體外誘導(dǎo)得到小鼠CD4+iTreg細(xì)胞，檢測Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg細(xì)胞IL-10和IL-10R表達(dá)水平。進(jìn)一步分選出Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg體外培養(yǎng)靜息培養(yǎng)4天，然后再刺激50小時，以及不同細(xì)胞因子IL-2或IL-27條件下，檢測IL-10和IL-10R表達(dá)水平。
　　實驗結(jié)果:
　　1.FCM結(jié)果顯示，小

7、鼠脾臟CD4+T、DC和NK細(xì)胞顯著表達(dá)Nrp-1，而Helios主要在CD4+T細(xì)胞表達(dá);Nrp-1和Helios在胸腺CD4+Foxp3+T細(xì)胞(tTreg)都表達(dá)，Nrp-1表達(dá)水平低于Helios，然而Helios在胸腺CD4+Foxp3-T細(xì)胞也有較高的表達(dá)。另外，Nrp-1和Helios在淋巴結(jié)、脾臟和外周血CD4+Foxp3+T細(xì)胞表達(dá)，但Nrp-1表達(dá)水平高于Helios。
　　2.骨髓移植重建模型結(jié)果顯示，8周后

8、分離得到淋巴結(jié)、脾臟和外周血，CD4+Foxp3+T細(xì)胞(pTreg)顯著表達(dá)Nrp-1和Helios。
　　3.IL-2和TGF-β體外培養(yǎng)的iTreg細(xì)胞Nrp-1和Helios表達(dá)明顯升高，尤其在CD4+Foxp3+iTreg細(xì)胞，Nrp-1在CD4medT細(xì)胞（IL-2，無TGF-β條件下）低表達(dá)，Helios在CD4medT細(xì)胞有一定的表達(dá)。Th0、Th1、Th2和Th17細(xì)胞Nrp-1和Helios低表達(dá)。
　　

9、4.體外培養(yǎng)的iTreg細(xì)胞第3-13天Nrp-1明顯升高，Nrp-1+/Foxp3+達(dá)70％左右; Helios表達(dá)水平在第3天達(dá)高峰，之后表達(dá)下降。
　　5.體外培養(yǎng)的iTreg細(xì)胞表達(dá)Nrp-1和Helios依賴于TGF-β信號(ALK5i)，不依賴于Smad3和JNK信號通路。
　　6.體外穩(wěn)定性實驗顯示，Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg體外培養(yǎng)第4和7天，Nrp-1+iTreg細(xì)胞Foxp3GFP表達(dá)

10、水平高于Nrp-1-iTreg細(xì)胞，而IFN-γ表達(dá)水平低于Nrp-1-iTreg細(xì)胞。體內(nèi)穩(wěn)定性實驗顯示，細(xì)胞輸注后第4、7和12天Nrp-1+iTreg細(xì)胞Foxp3GFP表達(dá)水平高于Nrp-1-iTreg細(xì)胞，而第7和12天IFN-γ和IL-17A表達(dá)水平低于Nrp-1-iTreg細(xì)胞。
　　7.體外抑制實驗顯示，Nrp-1+iTreg和Nrp-1-iTreg細(xì)胞都能抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖，Nrp-1+iTreg的

11、抑制作用優(yōu)于Nrp-1-iTreg細(xì)胞，而Nrp-1-Foxp3-CD4+T細(xì)胞沒有抑制功能。
　　8.體內(nèi)抑制實驗顯示，Nrp-1+iTreg，Nrp-1-iTreg，Nrp-1+Foxp3-CD4+T和Nrp-1-Foxp3-CD4+T細(xì)胞分別與CD4+CD25-CD45RBhiT細(xì)胞一同轉(zhuǎn)移至Rag1-/-小鼠，后兩群Foxp3-CD4+T細(xì)胞不能抑制腸炎;而前兩群iTreg細(xì)胞都能抑制腸炎，減緩體重下降，減輕腸道炎癥，抑制

12、Th1和Th17細(xì)胞，Nrp-1+iTreg的抑制功能優(yōu)于Nrp-1-iTreg細(xì)胞。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，Nrp-1+iTreg來源細(xì)胞Foxp3表達(dá)高于Nrp-1-iTreg，IFN-γ和IL-17A表達(dá)水平低于Nrp-1-iTreg細(xì)胞，提示Nrp-1+iTreg在炎癥狀態(tài)下具有更強的免疫抑制功能和更好的穩(wěn)定性。
　　9.體外實驗顯示，Nrp-1+iTreg細(xì)胞IL-10和IL-10R表達(dá)水平高于Nrp-1-iTreg。靜息培養(yǎng)4

13、天后再刺激，無細(xì)胞因子或IL-2或IL-27條件下，Nrp-1+iTreg細(xì)胞IL-10和IL-10R表達(dá)水平都高于Nrp-1-iTreg細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.Nrp-1在正常小鼠胸腺和外周淋巴器官Foxp3+CD4+T細(xì)胞高表達(dá)，也在造血干細(xì)胞來源的外周Treg細(xì)胞(pTreg)和體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞(iTreg)高表達(dá)，而在其他效應(yīng)細(xì)胞Th1/Th2/Th17低表達(dá)，提示Nrp-1不僅在tTreg和pTreg細(xì)胞表

14、達(dá)升高，還是iTreg細(xì)胞表面標(biāo)志;Helios雖然在tTreg細(xì)胞、pTreg和iTreg表達(dá)較高水平，但Helios在胸腺CD4+Foxp3-T細(xì)胞和體外激活的CD4+Foxp3-T細(xì)胞（IL-2，無TGF-β條件下培養(yǎng)CD4medT細(xì)胞）表達(dá)，提示Helios特異性不高，不能作為tTreg和iTreg細(xì)胞的標(biāo)志。
　　2.在非炎癥狀態(tài)下，體內(nèi)和體外實驗證實Nrp-1+iTreg細(xì)胞抑制功能和穩(wěn)定性優(yōu)于Nrp-1-iTreg細(xì)

15、胞;在炎癥狀態(tài)下，Nrp-1+iTreg細(xì)胞仍具有抑制功能和穩(wěn)定性，優(yōu)于Nrp-1-iTreg細(xì)胞，其機制可能與Nrp-1+iTreg細(xì)胞高表達(dá)IL-10和IL-10R，維持Foxp3的表達(dá)，向Th1和Th17細(xì)胞分化抵抗有關(guān)。
　　3.我們鑒定了一群具有免疫抑制功能和高穩(wěn)定性的Nrp-1+iTreg細(xì)胞，容易體外培養(yǎng)和獲取，為臨床提供大量Nrp-1+iTreg細(xì)胞，不像tTreg和pTreg細(xì)胞因數(shù)量少而限制應(yīng)用。這些發(fā)現(xiàn)為臨床