COP1在高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球足細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：探討COP1在高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球足細(xì)胞凋亡中的作用及其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：將培養(yǎng)的足細(xì)胞分別以15、30、45mmol/L D-葡萄糖刺激12、24、48h,收集各組細(xì)胞和對照組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡率和死亡率,確定最佳劑量的葡萄糖刺激濃度和時間。再將新培養(yǎng)的足細(xì)胞分為對照組、高糖組(30mmol/L)和甘露醇組(30mmol/L),作用48h后,流式細(xì)胞儀、TLJNEL法檢測各組腎小球足細(xì)胞凋亡率。C

2、OP1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-COP1和空載體pEGFP-N1質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后,采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,流式細(xì)胞儀檢測真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率,半定量RT-PCR和Western blot方法分別檢測COP1 mRNA和蛋白表達(dá)。分別以30mmol/L葡萄糖刺激足細(xì)胞48h,細(xì)胞分為對照組、甘露醇組、高糖組、pEGFP-COP1轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組。流式細(xì)胞儀、TUNEL法檢測各組腎小球足

3、細(xì)胞凋亡率,RT-PCR和Western blot法分別檢測各組COP1 mRNA和蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：通過對小鼠腎小球足細(xì)胞凋亡指數(shù)和死亡指數(shù)在不同濃度葡萄糖隨時間變化比較,確定實驗中誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的最佳劑量的葡萄糖濃度為30mmol/L,刺激時間為48h。30mmol/L葡萄糖刺激小鼠足細(xì)胞48h后,足細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05),30mmol/L甘露醇作用48h后,足細(xì)胞凋亡指數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)

4、計學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)酶切和測序鑒定,COP1真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。瞬時轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pEGFP-COP1和pEGFP-N1的足細(xì)胞在熒光顯微鏡下可檢測到綠色熒光信號,流式細(xì)胞儀檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率在30％-40%。轉(zhuǎn)染pEGFP-COP1的足細(xì)胞經(jīng)RT-PCR、Western blot鑒定COP1基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平獲得高表達(dá)(P＜0.05)。pEGFP-COP1轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,與30mmol/L葡萄糖孵育48h后,細(xì)胞凋亡率較高糖組明

5、顯降低,差異有顯著性(P＜0.05),與對照組和甘露醇組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Pegfp-N1轉(zhuǎn)染組足細(xì)胞凋亡率與高糖組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),明顯高于對照組和甘露醇組,差異有顯著性(P＜0.05)。pEGFP-COP1轉(zhuǎn)染組COP1 mRNA表達(dá)較高糖組明顯增加,差異有顯著性(P＜0.05),與對照組和甘露醇組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);pEGFP-N1組COP1 mRNA表達(dá)與高糖組差異無統(tǒng)計學(xué)意義