應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)篩選豬前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的基因.pdf

1、脂肪組織的生長與脂肪細(xì)胞體積增大及前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞有關(guān)。在前脂肪細(xì)胞分化過程中伴隨著許多基因的特異性表達(dá),細(xì)胞形態(tài)亦有相應(yīng)的變化。豬是脂肪沉積能力很強(qiáng)的動物之一,脂肪在皮下組織和內(nèi)臟器官的過度沉積是影響豬肉品質(zhì)的重要因素。本研究采用mRNA差異顯示技術(shù)篩選豬前脂肪細(xì)胞分化過程相關(guān)的差異表達(dá)基因,為進(jìn)一步研究豬脂肪沉積代謝的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 試驗(yàn)1、豬前脂肪細(xì)胞的分離與鑒定。
　　 取3日齡健康仔豬頸部

2、皮下脂肪組織,利用膠原酶消化法分離豬前脂肪細(xì)胞,進(jìn)行原代培養(yǎng),并采用MTT法、油紅O染色、LPL活性測定來鑒定豬前脂肪細(xì)胞。結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的豬前脂肪細(xì)胞在經(jīng)歷短暫的遲緩期后,進(jìn)入對數(shù)生長期,直至第7天開始進(jìn)入平臺期,在培養(yǎng)第10天開始出現(xiàn)細(xì)胞調(diào)亡。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),原代培養(yǎng)的豬前脂肪細(xì)胞從第3天開始充脂,細(xì)胞內(nèi)脂肪滴被油紅O染成紅色,此后伴隨細(xì)胞增殖和分化,充脂細(xì)胞逐漸增多,小脂滴不斷匯聚形成大脂滴,細(xì)胞也由梭形逐漸變圓,體積增大

3、。同時,LPL活性也呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。上述結(jié)果證實(shí)豬前脂肪細(xì)胞已被成功分離。
　　 試驗(yàn)2、豬前脂肪細(xì)胞分化過程差異表達(dá)基因的篩選
　　 為進(jìn)一步探討豬前脂肪細(xì)胞分化過程中可能表達(dá)的調(diào)控基因,采用mRNA差異顯示技術(shù)來篩選與其分化有關(guān)的差異表達(dá)基因。分別收集原代培養(yǎng)3天、5天、7天、10天的豬前脂肪細(xì)胞,用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。通過RT-PCR和6％聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯色后,回收差異條帶,并用

4、PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段克隆至pMD18-T載體中,測定其核苷酸序列,并將測序結(jié)果與Genbank中相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明:
　　 (1)采用DDRT-PCR技術(shù)成功獲得20條EST序列,Blast在線分析結(jié)果表明,其中A22、A23、A33、A43、A55、A73、B42、C44等8個ESTs序列與Genbank數(shù)據(jù)庫已報告的基因具有高度的同源性；A21、A32、A45、B41等4個ESTs序列與Genbank數(shù)據(jù)庫

5、已報告的基因同源性較低,其功能尚不明確；A31、A53、A24、B31、B71、C21、C62、C81等8個基因ESTs序列為本研究首次發(fā)現(xiàn)。
　　 (2)A21、A23、A31、A32、A43、A53、B31、B71、C21、C62均表達(dá)于豬前脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)的第3天和第5天,可能與前脂肪細(xì)胞增殖有關(guān)；A22在前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)的第3、5、7天表達(dá),在第10天沒有表達(dá)或者是表達(dá)量很低,推測A22的表達(dá)與前脂肪細(xì)胞增殖、分化的轉(zhuǎn)換和