骨質(zhì)疏松癥脂肪干細胞Wnt信號通路相關(guān)差異基因篩選的實驗研究.pdf

1、第一部分:骨質(zhì)琉松小鼠模型建立及骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞的分離培養(yǎng)鑒定
　　目的:骨質(zhì)疏松病(Osteoporosis)的發(fā)病機制在于骨重建過程中成骨活動下降，破骨活動上升，導致骨代謝平衡被破壞，骨組織吸收大于形成。最終導致密質(zhì)骨變薄，骨小梁密度減低，骨質(zhì)疏松，骨折發(fā)生幾率增加，骨愈合能力降低[1]。脂肪干細胞來源豐富，易于獲取，以往對于脂肪干細胞的研究已證實該細胞具有骨向分化的潛能[2]，而骨質(zhì)疏松脂肪干細胞是否具有同樣的成骨能力

2、尚未見報道。本實驗通過建立小鼠骨質(zhì)疏松模型，分離培養(yǎng)建模成功的骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞(OP-ASCs)。為研究骨質(zhì)疏松癥脂肪干細胞Wnt信號通路相關(guān)差異基因篩選的實驗提供細胞支持。
　　方法:①將雌性C57BL/6小鼠隨機分為實驗組（去勢組）和對照組（假手術(shù)組）。去勢組取10周齡小鼠（體重18～20克），切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后4w、8w，從去勢組和假手術(shù)組隨機選取6只小鼠，麻醉后，采用micro-CT測定股骨中間骨干的骨體積分數(shù)（bo

3、ne volume fraction，BV/TV，％），通過對照上述指標從影像學角度證明骨質(zhì)疏松小鼠造模成功。再從去勢組和假手術(shù)組中隨機選取6只小鼠，取其膝關(guān)節(jié)進行切片及HE、MASSON染色，通過觀察其骨小梁密度、骨密質(zhì)厚度判斷造模成功與否。②頸椎脫法處死小鼠，75％酒精浸泡小鼠進行全身消毒，取上述骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝脂肪組織，使用組織塊法將小鼠脂肪組織剪碎，翻轉(zhuǎn)干涸，于含10％FBSα-MEM培養(yǎng)基中進行小鼠OP-ASCs原代培養(yǎng)，酶

4、消化法進行細胞傳代，傳代至第二代時，得出所需骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞。③所得骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞進行流式細胞學檢測，證明其干細胞特性。
　　結(jié)果:從影像學及組織學方面證明去勢法構(gòu)建骨質(zhì)疏松小鼠模型成功，通過流式細胞學檢測骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞，發(fā)現(xiàn)其干細胞表面抗體為陽性，符合干細胞特性，證明組織塊法自骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝脂肪取得的細胞確為骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞。
　　結(jié)論:通過去勢法我們成功建立了骨質(zhì)疏松小鼠動物模型，自取得的

5、骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝取得OP-ASCs。
　　第二部分骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞中Wnt信號通路的變化情況
　　目的:以往研究證實Wnt信號通路在骨髓間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞、正常的脂肪干細胞的骨向分化中起著至關(guān)重要的作用[3-5]，但在OP-ASCs中，Wnt信號通路是否與在其他種類的干細胞中一樣扮演著重要的角色，并且如果Wnt信號通路在OP-ASCs中同樣扮演著調(diào)控成骨的作用，其骨向分化的調(diào)控的具體分子機制尚待進一步研究。本研

6、究目的在于通過上調(diào)及下調(diào)Wnt信號通路，篩選出Wnt信號通路中基因差異性表達出的關(guān)鍵因子，從而與現(xiàn)有研究的其他干細胞中的Wnt信號通路的關(guān)鍵因子變化進行比較，并探究Wnt信號通路對OP-ASCs骨向分化的調(diào)控的具體分子機制，為骨質(zhì)疏松脂肪干細胞修復骨缺損等臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　方法:將小鼠重組DKK-1蛋白按照0.1μg/ml加入含10％FBSα-MEM培養(yǎng)基，LiCl以50mg/ml加入含10％FBSα-MEM培養(yǎng)基，將骨

7、質(zhì)疏松小鼠脂肪干細胞分為LiCl處理組、DKK-1處理組，并設(shè)置用10％FBSα-MEM培養(yǎng)基的對照組，在第一天、第三天兩個時間點提取細胞的總RNA，以Wnt信號通路PCR芯片結(jié)合Real-time PCR篩選出其中的Wnt信號通路有關(guān)的差異性基因。
　　結(jié)果:第一天時，LiCl組小鼠OP-ASCs與對照組相比，Ccnd1基因表達上調(diào)，Porcn、Sfrp1、Sfrp2、Sfrp4、Wnt5a基因表達降低，而DKK-1組小鼠OP-

8、ASCs與對照組相比，Axin1、Fzd6、Wnt5a基因表達上調(diào)。第三天時，LiCl組小鼠OP-ASCs與對照組相比，Wnt2基因表達水平上調(diào)，Nlk、Porcn、Wnt5a基因表達水平下調(diào);DKK-1組小鼠OP-ASCs與對照組相比，Wif1、Wnt5a基因表達水平上調(diào)。
　　結(jié)論:1.在OP-ASCs中，經(jīng)典Wnt信號通路同樣在調(diào)控這些基因的表達，我們推測LiCl的加入上調(diào)了OP-ASCs中激活經(jīng)典Wnt信號通路的Wnt2基

9、因表達，下調(diào)了抑制經(jīng)典Wnt信號通路的Porcn、Sfrp1、Sfrp2、Sfrp4基因，激活了經(jīng)典Wnt信號通路，從而使其下游基因Ccnd1表達上調(diào);而DKK-1的加入上調(diào)了經(jīng)典Wnt信號通路抑制劑Axin1、Wif1基因，從而抑制了經(jīng)典Wnt信號通路。2.LiCl的加入下調(diào)了非經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵因子Wnt5a、Nlk基因表達，從而抑制了非經(jīng)典Wnt信號通路，而DKK-1的加入上調(diào)了非經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵因子Wnt5a、Fz