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文檔簡介
1、脂肪組織是一種高度分化的組織,在胚胎發(fā)育晚期出現(xiàn),出生后迅速增長。脂肪組織的生長包括新脂肪細胞的生成(即脂肪細胞分化)和脂肪細胞體積的增大。脂肪細胞增強子結(jié)合蛋白(AEBPl)是在小鼠的肥胖研究中發(fā)現(xiàn)的一個脂肪細胞分化相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子。在脂肪組織脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)基因啟動子鄰近區(qū)域AE-1存在AEBPl的識別區(qū)域,而aP2基因編碼的蛋白可以作為脂肪細胞分化的標志。小鼠AEBPl基因通過選擇性剪接形成兩種轉(zhuǎn)錄本AEBPl和AC
2、LP(主動脈羧肽酶類樣蛋白),其編碼的兩種蛋白AEBPl和ACLP功能完全不同。目前,豬AEBPl基因的序列、結(jié)構(gòu)和功能尚未見報道,本研究首次利用電子克隆技術(shù)結(jié)合PCR,對豬AEBPl基因的部分cDNA和DNA序列進行了分離和測序,并對不同品種的豬AEBPl基因序列進行了生物信息學(xué)分析:利用豬輻射雜種克隆板(IMpRH)對豬AEBPl基因進行了染色體精細定位;利用RT-PCR方法對豬AEBPl基因是否存在不同轉(zhuǎn)錄本進行了鑒定,并分別對其
3、推導(dǎo)的氨基酸序列進行了生物信息學(xué)分析,預(yù)測蛋白質(zhì)的基本特征,同時在轉(zhuǎn)錄水平檢測了不同轉(zhuǎn)錄本在豬的各個組織表達分布情況。 為了確定豬脂肪細胞分化相關(guān)基因AEBPI和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)基因,脂肪沉積候選基因黑素皮質(zhì)素-4受體(MC4lR)基因、黑素皮質(zhì)素-5受體(MC5R)基因和胰島素樣生長因子-2(IGF2)基因以及肌內(nèi)脂肪含量候選基因PRKAG3的遺傳學(xué)效應(yīng),以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗豬場2002年屠宰的大白、長白
4、和梅山豬等三個品種和大白×長白、長白×大白、大白×梅山、梅山×大白豬(以下分別簡稱大長、長大、大梅、梅大)等四個雜交組合群體(共336頭)以及2003、2004年屠宰的大白×梅山豬F<,2>代群體(共290頭)為試驗材料,利用:PCR-RFLP分子標記技術(shù),對豬AEBPI、PPAR γ、MC4R、MC5R、IGF2和PRKAG3進行了基因型分型,并與背膘厚等胴體性狀、肌內(nèi)脂肪含量等肉質(zhì)性狀進行關(guān)聯(lián)性分析;此外,為了篩選更多的SNP,對豬
5、脂肪細胞分化相關(guān)基因脂肪細胞定向和分化因子(ADDll基因的不同豬品種DNA進行分離、測序并進行序列比對,取得了以下結(jié)果: 1.豬AEBPl基因cDNA和DNA序列的分離、測序和序列分析:以人AEBPl基因序列作為探針,在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中比對得到豬EST序列并進行拼接。 2.豬AEBPl和PNPLA2基因的染色體精細定位:根據(jù)豬AEBPl基因DNA序列設(shè)計引物AE-MAP F和AE-MAP R,利用豬輻射雜種克隆
6、板把豬AEBPl基因定位于SSCl8q24。兩點連鎖分析發(fā)現(xiàn)與豬AEBPl基因連鎖最緊密的標記是S0177(LOD=24.47,6cR),多點分析結(jié)果為SWl808-SW2540-TCRB-SWl984-SW787-SWl682-S0062-S0120-AEBPl-S0177-SWR414-SWRl69。 3.豬AEBPl/ACLP轉(zhuǎn)錄本鑒定:分別在豬AEBPl基因第8外顯子、第9內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計兩條上游引物(P8、P9),第10
7、、11外顯子設(shè)計兩條下游引物(P10、P11),通過不同引物組合P8-Pll、P9-P10和P9-Pll,以豬脂肪組織cDNA為模板擴增到大小不同的片段。對擴增產(chǎn)物進行測序,序列分析確定不同帶型分別代表豬AEBPl的兩種轉(zhuǎn)錄本AEBPl和ACLP。 4.豬AEBPl/ACLP轉(zhuǎn)錄本推導(dǎo)的蛋白質(zhì)基本特征分析:通過相似性比對發(fā)現(xiàn),推導(dǎo)的豬AEBPl氨基酸序列與小鼠AEBPl的相似性為95%;推導(dǎo)的豬ACLP氨基酸序列與人和小鼠ACL
8、P的相似性分別為90%和86%。PSORT軟件分析推導(dǎo)的豬AEBPl和ACLP蛋白可能都位于細胞質(zhì)中。 5. 轉(zhuǎn)錄水平組織表達譜分析:利用RT-PCR方法分別檢測到豬AEBPl/ACLP轉(zhuǎn)錄本在豬的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、腎、子宮、睪丸、胚胎、小腸和胃等12個組織中的表達情況。除ACLP轉(zhuǎn)錄本在小腸中未表達外,AEBPl和ACLP轉(zhuǎn)錄本在各個組織中均有表達,但表達豐度不一。總體而言,除肝臟和小腸外,AEBPl在各種組織中的豐
9、度均低于ACLP。 6. 豬脂肪細胞分化相關(guān)基因AEBPl、PPARγ),的性狀關(guān)聯(lián)分析:AEBPl基因內(nèi)含子9第324位C→A變異引起PstI酶切多態(tài)性:PPARγ),第175位A→G變異引起氨基酸改變(Met→Val),并引起B(yǎng)stI酶切多態(tài)性。 7. 豬脂肪細胞分化相關(guān)基因ADDl部分DNA序列的SNPs篩查:根據(jù)豬ADDJ基因mRNA序列設(shè)計引物,分別以大白和梅山豬DNA作為模板擴增,PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)序列比對發(fā)
10、現(xiàn)了8個潛在的SNPs,其中三個位于外顯子區(qū)域,但沒有引起氨基酸改變。將大白豬ADDl基因DNA序列提交GenBank,獲得登錄號DQ464433。 8.豬脂肪沉積相關(guān)候選基因MC4R、MC5R和IGF2的性狀關(guān)聯(lián)分析:MC4R基因G_A變異引起298位氨基酸改變(Asp→Asn)),并引起TaqI酶切多態(tài)性;MC5R基因G→A變異引起109位氨基酸改變(Ala→Thr),并引起B(yǎng)saHI酶切多態(tài)性;IGF2基因內(nèi)含子8的一個G
11、→C突變引起B(yǎng)cn,酶切多態(tài)性。 9.肌內(nèi)脂肪及糖原合成與代謝候選基因PRKAG3的性狀關(guān)聯(lián)分析:PRKAG3基因兩處堿基變異分別導(dǎo)致52和199位氨基酸改變(Gly52Ser、Ilel99Val),并分別引起Hphl.BsaHl酶切多態(tài)性。在大白、長白和梅山豬等三個品種和大長、長大、大梅、梅大豬等四個雜交組合群體分別進行PCR-Hph I-RFLP和PCR-BsaHo l-RFLP酶切分型,發(fā)現(xiàn)工199V位點在各個群體中I等位
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