甲狀腺相關(guān)眼病眼眶前脂肪細(xì)胞分化與HLA-DR相關(guān)因素的研究.pdf

1、目的：利用體外培養(yǎng)的甲狀腺相關(guān)眼?。╰hyroid associated ophthalmopathy，TAO）和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞，比較其超微結(jié)構(gòu)、表面抗原、脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)的差異；了解眼眶前脂肪細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原DR（human leucocyte antigen-DR，HLA-DR）的表達(dá)，研究干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）對前脂肪細(xì)胞分化過程中HLA-

2、DR表達(dá)的影響；探討匹格列酮和GW9662對眼眶前脂肪細(xì)胞增殖和分化的作用和分化過程中HLA-DR表達(dá)的影響。 方法：原代培養(yǎng)TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞并體外誘導(dǎo)分化。光鏡和電鏡下比較兩種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，免疫組化檢測細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)，脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化率比較兩者的脂肪分化能力。流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR研究IL-6、IFN-γ對細(xì)胞分化過程中HLA-DR表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。MTT法測定

3、匹格列酮、GW9662對前脂肪細(xì)胞增殖的影響，油紅O染色定量法測定匹格列酮、GW9662對前脂肪細(xì)胞分化的影響，流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR研究匹格列酮、GW9662對細(xì)胞分化過程中HLA-DR表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果：組織塊法和酶消化法均能從組織中獲取相同生物活性的眼眶前脂肪細(xì)胞，并成功向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化。電鏡下觀察TAO眼眶前脂肪細(xì)胞含有豐富的脂滴小體和脂質(zhì)沉積。流式細(xì)胞術(shù)檢測TAO眼眶前脂肪細(xì)胞表達(dá)HLA-DR陽性，

4、幾何平均熒光強(qiáng)度為14.93±0.73，與正常人（3.55±0.60）比較，差異有顯著性意義（P<0.05）。免疫組化法檢測TAO眼眶前脂肪細(xì)胞胞漿和胞膜表達(dá)HLA-DR陽性，而正常人表達(dá)陰性。體外誘導(dǎo)分化后，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（21.3％）較正常人（12.1％）增高，兩者間差異有顯著性意義（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR表達(dá)增強(qiáng)，幾何平均熒光強(qiáng)度為26.15±0.64，與分化前（

5、14.93±0.73）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)較分化前增強(qiáng)了9.3倍。加入IFN-γ刺激，TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)均有增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測其幾何平均熒光強(qiáng)度分別為45.26±1.28和14.59±0.62，與對照組（26.15±0.64和3.28±0.58）比較，差異有顯著性意義（P<0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢

6、測IFN-γ刺激下TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR表達(dá)較分化前增強(qiáng)了25.5倍，與對照組（9.3倍）比較，差異有顯著性意義（P<0.05）。加入IL-6刺激，TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)均無明顯變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測其幾何平均熒光強(qiáng)度分別為和27.28±1.30和4.35±0.26，與對照組（26.15±0.64和3.28±0.58）比較，差異無顯著性意義（P>0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測IL-6

7、刺激下TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR表達(dá)較分化前增強(qiáng)了9.6倍，與對照組（9.3倍）比較，差異無顯著性意義（P>0.05）。濃度為0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和50μmol/L的匹格列酮作用48h后，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞的OD值分別為0.046±0.005、0.051±0.004、0.060±0.003和0.020±0.004，后三組與對照組（0.046±0.004）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）

8、。濃度為0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和50μmol/L的匹格列酮作用48h后，正常人眼眶前脂肪細(xì)胞的OD值分別為0.047±0.006、0.050±0.003、0.056±0.004和0.018±0.005，后三組與對照組（0.047±0.005）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）。當(dāng)濃度達(dá)到1μmol/L，匹格列酮以濃度依賴性促進(jìn)TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞的增殖，對兩者增殖的作用差異無顯著性意義（P>0.

9、05）；當(dāng)濃度達(dá)到50μmol/L，TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)部分脫壁，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。濃度為0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol幾和50μmol/L的匹格列酮干預(yù)誘導(dǎo)分化后，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞的OD值分別為1.286±0.082、1.489±0.109、1.758±0.115和0.206±0.028，后三組與對照組（1.238±0.090）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）。濃度為0.1μmol/L、1μ

10、mol/L、10μmol/L和50μmol/L的匹格列酮干預(yù)誘導(dǎo)分化后，正常人眼眶前脂肪細(xì)胞的OD值分別為1.053±0.083、1.212±0.091、1.329±0.108和0.186±0.019，后三組與對照組（1.046±0.096）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）。當(dāng)濃度達(dá)到1μmol/L，匹格列酮以濃度依賴性促進(jìn)TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞的分化，且對TAO眼眶前脂肪細(xì)胞有更強(qiáng)的促分化作用，對兩者的促分化作用差異有顯著

11、性意義（P<0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到50μmol/L，TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)部分脫壁，細(xì)胞分化受到明顯抑制。濃度為0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和50μmol/L的GW9662干預(yù)誘導(dǎo)分化后，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞的OD值分別為1.235±0.106、1.031±0.062、0.608±0.050和0.156±0.013，后三組與對照組（1.238±0.090）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）。濃度為0

12、.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和50μmol/L的GW9662干預(yù)誘導(dǎo)分化后，正常人眼眶前脂肪細(xì)胞的OD值分別為1.045±0.085、0.942±0.073、0.605±0.041和0.131±0.011，后三組與對照組（1.046±0.096）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）。當(dāng)濃度達(dá)到1μmol/L，GW9662以濃度依賴性抑制TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞的分化，且對TAO眼眶前脂肪細(xì)胞的分化有更強(qiáng)的抑制

13、作用，對兩者的抑制分化作用差異有顯著性意義（P<0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到50 μmol/L，TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)部分脫壁，細(xì)胞分化受到明顯抑制。用10μmol幾濃度的匹格列酮和10μmol/L濃度的GW9662混合液干預(yù)前脂肪細(xì)胞分化后，TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞的OD值分別為0.635±0.083和0.630±0.084，與匹格列酮組（1.758±0.115和1.329±0.108）及對照組（1.238±0.090

14、和1.046±0.096）相比，差異有顯著性意義（P<0.05）。10μmol/L濃度的匹格列酮刺激下，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)有增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測其幾何平均熒光強(qiáng)度為34.19±1.09，與對照組（26.15±0.64）比較，差異有顯著性意義（P<0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測10μmol/L濃度匹格列酮刺激下，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR表達(dá)較對照組增強(qiáng)了3.1倍。10μmol/L濃度的GW

15、9662刺激下，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)有減弱，流式細(xì)胞術(shù)檢測其幾何平均熒光強(qiáng)度為17.34±0.94，與對照組（26.15±0.64）比較，差異有顯著性意義（P<0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測10μmol/L濃度GW9662刺激下，TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR表達(dá)為對照組的0.3倍。10μmol/L濃度匹格列酮和10μmol/L濃度GW9662不能刺激正常人眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)

16、，流式細(xì)胞術(shù)檢測其幾何平均熒光強(qiáng)度為4.03±0.57和3.26±0.31，與對照組（3.28±0.58）比較，差異無顯著性意義（P>0.05）。 結(jié)論：TAO和正常人眼眶前脂肪細(xì)胞存在著形態(tài)學(xué)和生物學(xué)上的差異，前者富含脂滴小體，脂肪轉(zhuǎn)化率高，表達(dá)HLA-DR，且在分化后表達(dá)增強(qiáng)，有可能參與眼眶脂肪組織的擴(kuò)增和眶內(nèi)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。IFN-γ能刺激眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)，因而上調(diào)局部免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)，使眼眶前脂肪

17、細(xì)胞成為一種抗原呈遞細(xì)胞，參與該病的自身免疫過程。IL-6不能刺激眼眶前脂肪細(xì)胞分化后HLA-DR的表達(dá)，說明未經(jīng)該途徑參與TAO眶內(nèi)炎癥病變的調(diào)節(jié)。匹格列酮可以促進(jìn)眼眶前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，刺激TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化過程中HLA-DR的表達(dá)，從而上調(diào)局部免疫反應(yīng)，有可能誘發(fā)和加重TAO的發(fā)生。GW9662可抑制眼眶前脂肪細(xì)胞的分化，拮抗匹格列酮對眼眶前脂肪細(xì)胞的促分化作用，并能抑制TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化過程中HLA-DR的表達(dá)，